博萊霉素肺損傷毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞間緊密連接與緊密連接蛋白-1的變化及意義.pdf

1、本實(shí)驗(yàn)通過高分辨率CT、光鏡、電鏡、免疫組織化學(xué)染色、激光共聚焦掃描等方法，動態(tài)觀察肺炎及肺纖維化大鼠肺組織所經(jīng)歷的病理過程，比較兩組間肺毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞緊密連接的超微結(jié)構(gòu)及其調(diào)節(jié)蛋白的變化差異，以期揭示肺炎與肺纖維化早期肺組織的特征性影像學(xué)表現(xiàn)及其病理學(xué)基礎(chǔ)，為肺纖維化的早期發(fā)現(xiàn)、早期診斷、早期治療提供新的思路，并為尋找肺纖維化的可逆轉(zhuǎn)環(huán)節(jié)提供理論依據(jù)。 研究材料與方法：健康SD大鼠90只，雌雄不拘，體重170～220g(由本

2、校實(shí)驗(yàn)動物中心提供)。隨機(jī)分為3組，即博萊霉素組、肺炎雙球菌組、正常對照組，每組30只。BLM組用10g.L-1戊巴比妥鈉(50mg.kg-1)腹腔麻醉大鼠，仰臥固定在鼠臺上。頸部酒精消毒后逐層暴露氣管，用1ml注射器抽取含博萊霉素-A5的溶液(天津太河制藥有限公司出品，8mg/支，批號040902，用生理鹽水配成4g.L-1溶液，按5mg.kg-1給藥)，接7號頭皮針上，經(jīng)氣管軟骨環(huán)間隙朝向心端刺入氣管，回抽見空氣無阻力后，將藥液注入

3、氣管。注入過程中將大鼠直立、旋轉(zhuǎn)，使藥液在肺內(nèi)分布充分、均勻。肺炎組在相同條件下向氣管內(nèi)注入肺炎雙球菌菌液0.15mL/只(中國藥品生物制品檢定所出品，細(xì)菌號31003，復(fù)蘇繁殖2代，稀釋成菌液，菌落數(shù)3×108/mL)；正常對照組在相同條件下向氣管內(nèi)注入0.25mL的生理鹽水，方法同實(shí)驗(yàn)組。分別于第1，3，7，14和28d隨機(jī)挑選各組中的6只大鼠行HRCT掃描后處死，其中一只大鼠用硝酸鑭心內(nèi)灌注固定的方法處死，切取少量肺組織制作成電鏡

4、標(biāo)本；其余大鼠經(jīng)10g/L多聚甲醛心內(nèi)灌注處死，取左全肺石蠟包埋，6um切片，HE、Masson染色。免疫組織化學(xué)染色采用兩步法檢測大鼠肺間質(zhì)中單核巨噬細(xì)胞的浸潤規(guī)律，嚴(yán)格按照Envision試劑盒使用說明操作，一抗為鼠抗人CD68單克隆抗體(丹麥DAKO公司出品)。激光共聚焦采用雙標(biāo)記間接免疫熒光細(xì)胞化學(xué)法檢測大鼠肺組織切片中緊密連接蛋白-1(ZO-1)的表達(dá)規(guī)律，嚴(yán)格按步驟操作，一抗為小鼠抗大鼠ZO-1單克隆抗體(美國CHEMICO

5、N公司出品)與兔抗鼠Ⅷ因子多克隆抗體(北京中山生物試劑公司出品)的混合抗體，二抗為山羊抗小鼠FITC熒光抗體與山羊抗兔TexRed熒光抗體(均為華美試劑有限公司出品)的混合抗體。 研究結(jié)果： 1.BLM性肺損傷早期，肺泡炎階段，肺組織影像學(xué)特點(diǎn)表現(xiàn)為雙肺野內(nèi)中帶片狀高密度影，以支氣管為中心呈放射狀分布，邊緣毛糙，境界不清。 2.肺炎第1～7d組大鼠肺組織以炎性損傷及滲出為主，表現(xiàn)為肺泡壁水腫，毛細(xì)血管擴(kuò)張，肺泡腔

6、內(nèi)大量炎性滲出液，中性粒細(xì)胞及巨噬細(xì)胞浸潤；肺出血及實(shí)變。至第14d組炎性滲出消失，肺泡間隔稍厚。第28d組肺組織結(jié)構(gòu)完整，與正常對照組比較未見明顯差異。BLM第1～7d組大鼠肺組織出血、實(shí)變。肺泡結(jié)構(gòu)破壞、萎陷。第14d組，肺泡及間質(zhì)內(nèi)有明顯纖維素樣物質(zhì)沉積。至第28d組，部分肺泡腔消失，肺泡壁顯著增厚。 3.肺炎組及BLM組早期(第1～7d組)肺間質(zhì)內(nèi)單核巨噬細(xì)胞陽性面積比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p＞0.05)。后期(第14～28

7、d組)，肺炎組肺間質(zhì)內(nèi)巨噬細(xì)胞陽性面積比與正常對照組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p＞0.05)；而BLM組肺間質(zhì)內(nèi)巨噬細(xì)胞仍較多，與正常對照組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p＜0.05)。 4.肺炎第1d組，毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞間緊密連接已有顯著開放。第3～7d組，絕大部分內(nèi)皮細(xì)胞間緊密連接完全開放，鑭顆粒通過細(xì)胞連接，并沉積在基膜上。第14d組基膜完整，少數(shù)區(qū)域內(nèi)皮細(xì)胞間緊密連接仍有部分開放。第28d組內(nèi)皮細(xì)胞結(jié)構(gòu)完整，細(xì)胞間縫隙關(guān)閉。BL

8、M第1～28d組內(nèi)皮細(xì)胞間緊密連接始終處于不同程度的開放狀態(tài)，可見鑭顆粒通過細(xì)胞連接，并在管腔外沉積，其中以3～14d組最為明顯。 5.肺炎第1～28d組，毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞ZO-1蛋白表達(dá)呈穩(wěn)步上升趨勢，至第28d組，其ZO-1蛋白表達(dá)與正常對照組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p＞0.05)；BLM第1d～28d，ZO-1表達(dá)呈逐漸上升趨勢，但至第28d，其表達(dá)水平仍顯著低于正常對照組，兩組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p＜0.05)。

9、 研究結(jié)論： 1.BLM所致肺泡炎影像學(xué)表現(xiàn)與肺炎雙球菌性肺泡炎影像學(xué)表現(xiàn)相比具有一些不同的特點(diǎn)：BLM肺泡炎程度重，炎癥所致片狀致密影范圍大，并以主支氣管為中心分布，有沿支氣管束呈放射狀延伸的趨勢；肺間質(zhì)浸潤明顯。 2.肺炎雙球菌性肺損傷，肺毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞間緊密連接隨肺組織結(jié)構(gòu)的完全修復(fù)而逐漸關(guān)閉；BLM性肺損傷第28d組，肺組織纖維化已經(jīng)形成，但仍有部分肺毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞間緊密連接處于開放狀態(tài)。 3.BLM