糖皮質(zhì)激素對(duì)大鼠視網(wǎng)膜血管內(nèi)皮細(xì)胞緊密連接的影響.pdf

1、目的 研究糖皮質(zhì)激素對(duì)大鼠視網(wǎng)膜血管內(nèi)皮細(xì)胞間緊密連接蛋白表達(dá)、分布及其功能的影響，從新的角度對(duì)糖皮質(zhì)激素治療黃斑水腫的藥物作用機(jī)制進(jìn)行探討。 方法 一、大鼠視網(wǎng)膜血管內(nèi)皮細(xì)胞分離與培養(yǎng) (一)大鼠視網(wǎng)膜血管內(nèi)皮細(xì)胞的分離純化與原代培養(yǎng) 使用兩種方法對(duì)大鼠視網(wǎng)膜血管內(nèi)皮細(xì)胞進(jìn)行分離純化： 1.通過(guò)細(xì)胞貼壁時(shí)間不同對(duì)大鼠視網(wǎng)膜血管內(nèi)皮細(xì)胞進(jìn)行分離純化。 自大鼠眼球中分離獲得視網(wǎng)膜后，

2、使用由含有10％胎牛血清的低糖型DMEM配制成的0.1％Ⅰ型膠原酶對(duì)視網(wǎng)膜進(jìn)行消化60分鐘，將消化產(chǎn)物通過(guò)75μm和50μm不銹鋼細(xì)胞篩網(wǎng)過(guò)濾，收集濾液離心1000轉(zhuǎn)/分鐘，10分鐘，去上清，加入培養(yǎng)基(含有20％胎牛血清，100U/ml青霉素，100μg/ml鏈霉素，100μg/ml血管內(nèi)皮生長(zhǎng)添加劑，10U/ml肝素的低糖型DMEM)吹打成細(xì)胞懸液，直接接種于培養(yǎng)板上，置37℃，5％CO2孵箱內(nèi)孵育3小時(shí)后吸出培養(yǎng)液及未貼壁細(xì)胞，加

3、入新鮮培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)。 2.使用CD31抗體包被的免疫磁珠對(duì)大鼠視網(wǎng)膜血管內(nèi)皮細(xì)胞進(jìn)行分離純化 (1)制備磁珠 取包被有抗小鼠IgG1抗體的免疫磁珠50μl與20μl小鼠抗大鼠CD31抗體混合，置4℃過(guò)夜。使用前，用含有10％胎牛血清的低糖型DMEM洗滌3次，每次置磁珠分離器上15分鐘，備用。 (2)分離細(xì)胞 將視網(wǎng)膜按前述方法進(jìn)行處理，形成單細(xì)胞懸液，加入含有10％胎牛血清的低糖型DMEM漂洗一

4、次，再次離心1000轉(zhuǎn)/分鐘，5分鐘，去除上清，再加入含有10％胎牛血清的低糖型DMEM約2ml吹打成細(xì)胞懸液加入制備好的磁珠，室溫，不斷攪動(dòng)下孵育一小時(shí)。將細(xì)胞懸液放置于磁珠分離器上8分鐘，將試管內(nèi)的液體吸出，洗滌6次。將得到的細(xì)胞加入培養(yǎng)基(含有20％胎牛血清，100U/ml青霉素，100μg/ml鏈霉素，100μg/ml血管內(nèi)皮生長(zhǎng)添加劑，10U/ml肝素的低糖型DMEM)吹打成細(xì)胞懸液，直接接種于使用纖維連接蛋白包被的培養(yǎng)板上，

5、置37℃，5％CO2孵箱內(nèi)培養(yǎng)。 (二)細(xì)胞傳代： 使用0.25％胰蛋白酶對(duì)細(xì)胞單層進(jìn)行消化，按1∶3進(jìn)行傳代。 (三)細(xì)胞鑒定： 觀察細(xì)胞形態(tài)，并通過(guò)免疫熒光方法對(duì)細(xì)胞內(nèi)vW因子表達(dá)進(jìn)行檢測(cè)。二、糖皮質(zhì)激素對(duì)細(xì)胞間緊密連接的影響 取傳至第四代到第六代視網(wǎng)膜血管內(nèi)皮細(xì)胞，分為低糖組、低糖+地塞米松組、高糖組和高糖+地塞米松組，共四組，并接種于Millicell插入式細(xì)胞培養(yǎng)皿、預(yù)置蓋玻片的24孔板

6、和普通24孔板中，分別進(jìn)行跨細(xì)胞電阻測(cè)定，緊密連接蛋白o(hù)ccludin、claudin-1和ZO-1的免疫熒光染色以及通過(guò)RT-PCR對(duì)claudin-1蛋白mRNA表達(dá)水平進(jìn)行檢測(cè)。通過(guò)預(yù)實(shí)驗(yàn)確定觀察時(shí)間為6天。 (一)跨細(xì)胞電阻測(cè)量 將視網(wǎng)膜血管內(nèi)皮細(xì)胞接種于Millicell插入式細(xì)胞培養(yǎng)皿，每日進(jìn)行跨細(xì)胞電阻測(cè)量，評(píng)估緊密連接功能。設(shè)置1組未接種細(xì)胞的空白對(duì)照組，每孔每次測(cè)定3處電阻值，取其平均電阻值。每孔電阻值

7、=每孔測(cè)定平均電阻值-空白對(duì)照孔測(cè)定平均電阻值。得到的各組數(shù)據(jù)使用SPSS11.5統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，規(guī)定P＜0.05時(shí)差別有顯著性。 (二)緊密連接蛋白免疫熒光染色 將視網(wǎng)膜血管內(nèi)皮細(xì)胞接種于預(yù)先放置蓋玻片的24孔板中，加入不同成分的培養(yǎng)基后，取處理2、4及6天的視網(wǎng)膜血管內(nèi)皮細(xì)胞進(jìn)行緊密連接蛋白ZO-1、occludin和claudin-1的免疫熒光檢測(cè)，觀察緊密連接蛋白在細(xì)胞內(nèi)的分布情況。 (三)RT-PCR

8、檢測(cè)claudin-1蛋白mRNA表達(dá)水平 將視網(wǎng)膜血管內(nèi)皮細(xì)胞接種于普通24孔培養(yǎng)板中，加入四組不同的細(xì)胞培養(yǎng)基分別對(duì)細(xì)胞進(jìn)行處理，取處理第2、4和6天細(xì)胞通過(guò)RT-PCR對(duì)緊密連接蛋白claudin-1的mRNA表達(dá)水平進(jìn)行檢測(cè)。PCR所用引物根據(jù)大鼠claudin-1mRNA序列，使用primer3軟件進(jìn)行設(shè)計(jì)，序列如下： claudin-1上游：5’aggtctggcgacattagtgg3’claudin-1下

9、游：5’gaaggtgttggcttgggata3’PCR產(chǎn)物片段大小為228bp。 結(jié)果 一、大鼠視網(wǎng)膜血管內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng) 1.兩種培養(yǎng)方法均可獲得純化的大鼠視網(wǎng)膜血管內(nèi)皮細(xì)胞，光學(xué)纖維鏡下細(xì)胞形態(tài)無(wú)明顯差別。但是通過(guò)細(xì)胞貼壁時(shí)間不同對(duì)大鼠視網(wǎng)膜血管內(nèi)皮細(xì)胞進(jìn)行分離純化的方法并不可靠，可重復(fù)性差。 2.培養(yǎng)得到的細(xì)胞通過(guò)形態(tài)學(xué)標(biāo)準(zhǔn)和免疫熒光鑒定，證實(shí)為血管內(nèi)皮細(xì)胞。 二、糖皮質(zhì)激素對(duì)細(xì)胞間緊密連接

10、的影響 (一)跨細(xì)胞電阻測(cè)量 處理一天時(shí)各處理組間電阻值無(wú)顯著差異。處理兩天以上，加入地塞米松的兩個(gè)處理組電阻值與未加入地塞米松的兩個(gè)處理組電阻值之間有差異，通過(guò)原始數(shù)據(jù)可以看出前者均較后者高。但是加入地塞米松的兩個(gè)處理組電阻值之間和未加入地塞米松的兩個(gè)處理組電阻值之間未見(jiàn)明顯差異。通過(guò)對(duì)相同處理組間，不同處理時(shí)間各電阻值進(jìn)行比較，可以發(fā)現(xiàn)使用地塞米松處理細(xì)胞2天后電阻值既可升高并趨于穩(wěn)定。 (二)緊密連接蛋白免

11、疫熒光染色 緊密連接蛋白o(hù)ccludin、claudin-1和ZO-1均表達(dá)于視網(wǎng)膜血管內(nèi)皮細(xì)胞的胞漿中。低糖組與高糖組細(xì)胞緊密連接蛋白的分布未見(jiàn)明顯差異，使用含有地塞米松培養(yǎng)液處理的兩組細(xì)胞間緊密連接蛋白分布可見(jiàn)向細(xì)胞漿的外周聚集。 (三)RT-PCR檢測(cè)claudin-1蛋白mRNA表達(dá)水平 使用含有地塞米松培養(yǎng)液培養(yǎng)的兩組細(xì)胞間緊密連接蛋白claudin-1mRNA表達(dá)水平，均較使用不含地塞米松培養(yǎng)液培養(yǎng)的

12、兩組細(xì)胞升高，培養(yǎng)6天時(shí)尤其明顯。 結(jié)論 1.使用CD31抗體包被的免疫磁珠對(duì)大鼠視網(wǎng)膜血管內(nèi)皮細(xì)胞進(jìn)行分離純化較根據(jù)細(xì)胞貼壁速度不同對(duì)其進(jìn)行純化的方法可靠，可重復(fù)性較好。 2.糖皮質(zhì)激素可以使體外培養(yǎng)的大鼠視網(wǎng)膜血管內(nèi)皮細(xì)胞跨細(xì)胞電阻升高、緊密連接蛋白重分布并使緊密連接蛋白claudin-1的mRNA表達(dá)水平升高。 3.在6天的觀察期內(nèi)，較低糖型DMEM而言，高糖型DMEM未引起緊密連接功能、蛋白分布以