糖皮質(zhì)激素對人股骨頭骨微血管內(nèi)皮細(xì)胞功能的影響.pdf

1、背景:
　　激素性股骨頭壞死目前發(fā)病機(jī)制仍不明確，近期研究認(rèn)為與微血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷密切相關(guān)，但現(xiàn)有相關(guān)研究并沒有使用骨微血管內(nèi)皮細(xì)胞行激素性股骨頭壞死基礎(chǔ)研究。而且早期骨微血管內(nèi)皮細(xì)胞的分離培養(yǎng)方法是取髂骨內(nèi)骨髓游離內(nèi)皮細(xì)胞用于血液系統(tǒng)疾病研究，不能真正地代表襯于骨骼系統(tǒng)血管內(nèi)壁的內(nèi)皮細(xì)胞。因此分離和培養(yǎng)股骨頭骨微血管內(nèi)皮細(xì)胞并使用該細(xì)胞研究激素性股骨頭壞死更有意義。
　　目的:
　　研究目的之一是探討人股骨頭骨微血管

2、內(nèi)皮細(xì)胞分離、培養(yǎng)方法，建立人股骨頭微血管內(nèi)皮細(xì)胞系，為后期實(shí)驗(yàn)研究提供細(xì)胞來源。目的之二是通過基因芯片對人股骨頭骨微血管內(nèi)皮細(xì)胞基因表達(dá)譜分析及實(shí)時定量PCR驗(yàn)證，探討糖皮質(zhì)激素對骨微血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷后發(fā)生的功能變化。
　　方法:
　　為了達(dá)到第一個研究目的，研究Ⅰ中選擇30例行髖關(guān)節(jié)置換患者切除的內(nèi)部無病變的股骨頭，男4例，女26例;年齡38-92歲，平均71.2歲。無菌條件下將股骨頭內(nèi)松質(zhì)骨咬成碎骨粒，放入培養(yǎng)基。采用

3、酶消化法，密度梯度離心法分離細(xì)胞;差速貼壁法，完全性內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)基培養(yǎng)，內(nèi)皮細(xì)胞生長因子以及肝素刺激內(nèi)皮細(xì)胞生長來純化細(xì)胞。倒置顯微鏡觀察培養(yǎng)細(xì)胞的形態(tài)學(xué)特點(diǎn)及生長特性，并采用vWF、CD31、VE-cadherin、VCAM-1免疫熒光進(jìn)行細(xì)胞鑒定。
　　為了實(shí)現(xiàn)第二個研究目的，選擇第三代BMECs進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。根據(jù)本實(shí)驗(yàn)室前期研究成果，使用0.1mg/ml和0.3mg/ml的含氫化可的松的培養(yǎng)基培養(yǎng)細(xì)胞，建立糖皮質(zhì)激素骨微血管內(nèi)皮

4、細(xì)胞損傷模型。設(shè)正常對照組，對照組不加氫化可的松。加藥后培養(yǎng)6、12、18、24小時倒置顯微鏡下觀察。24小時后經(jīng)Trizol法提取細(xì)胞樣品的總RNA。使用晶芯(@)mRNA表達(dá)譜芯片對細(xì)胞損傷模型和對照組進(jìn)行差異性轉(zhuǎn)錄本檢測，選擇內(nèi)皮細(xì)胞與血管舒縮相關(guān)、反映凝血與纖溶以及與血管發(fā)生相關(guān)的基因行qPCR驗(yàn)證。
　　結(jié)果:
　　研究Ⅰ中原代培養(yǎng)24h后相差顯微鏡下觀察細(xì)胞數(shù)量與患者年齡呈正相關(guān)，年齡越大細(xì)胞越少。4-5d后細(xì)胞

5、呈短梭形、多角形或“鵝卵石”狀。7-10d后細(xì)胞生長密集，細(xì)胞融合呈漩渦狀，接觸抑制明顯。vWF、CD31免疫熒光檢測陽性率100％，VE-cadherin和VCAM-1抗體免疫熒光檢測陽性率接近100％均證明了本實(shí)驗(yàn)培養(yǎng)的細(xì)胞是股骨頭BMECs。
　　研究Ⅱ中給予0.1mg/mL的氫化可的松干預(yù)的實(shí)驗(yàn)組BMECs與對照組比較呈收縮狀態(tài)，體積變小，12-24小時見細(xì)胞出現(xiàn)生長抑制，狀態(tài)差，細(xì)胞密度降低。0.3mg/mL的氫化可的松

6、作用后可見大部分細(xì)胞凋亡。而對照組細(xì)胞則生長狀態(tài)良好，漸趨融合。因此我們選擇0.1mg/mL的氫化可的松作用24小時后的細(xì)胞進(jìn)行mRNA芯片檢測。mRNA表達(dá)譜芯片表達(dá)基因篩選結(jié)果發(fā)現(xiàn)實(shí)驗(yàn)組BMECs與對照組比較共有差異表達(dá)基因519個，其中337個基因上調(diào)，182個基因下調(diào)。其中內(nèi)皮細(xì)胞與血管舒縮相關(guān)、反應(yīng)凝血與纖溶以及與血管發(fā)生相關(guān)的基因如ICAM-1、ET-1受體、PAI-1、血管緊張素Ⅱ受體較對照組明顯上調(diào)，eNOS、ET-1、