糖皮質激素對內皮祖細胞功能影響及糖皮質激素相關性股骨頭壞死患者外周血內皮祖細胞功能的實驗研究.pdf

1、第一部分、外周血hEPCs分離、培養(yǎng)及鑒定
　　 目的：分離、培養(yǎng)及純化人外周血內皮祖細胞，并進行鑒定。
　　 方法：10例20-40歲男性骨科取內固定患者，無髖部外傷史，無心血管疾病史，無可能存在有新生血管形成狀態(tài)如腫瘤或腎病史。抽取外周血20ml，Ficoll密度梯度離心法分離培養(yǎng)內皮祖細胞，然后采用形態(tài)學觀察、流式細胞分析、Dil-acLDL吞噬實驗及UEA-1結合實驗等鑒定。
　　 結果：培養(yǎng)3天后，部分

2、細胞呈長梭狀;培養(yǎng)7天后出現典型的放射狀“克隆集落”樣結構。培養(yǎng)10天后，用EPCs特異性標記物CD133和CD34進行免疫熒光鑒定，共聚焦顯微鏡下可觀察到所有細胞均同時表達CD133和CD34;EPCs能攝取DiI-ac-LDL，熒光顯微鏡下可觀察到紅色熒光;而且還能結合FITC-UEA-1，熒光顯微鏡下可觀察到綠色熒光。
　　 結論：利用密度梯度離心法從人外周血可分離、獲得純度較高內皮祖細胞。
　　 第二部分、不同種

3、類及濃度糖皮質激素對外周血hEPCs活性及成血管功能影響
　　 目的：觀察不同種類和濃度糖皮質激素對外周血內皮祖細胞活性及其最重要功能—形成新生血管能力的影響。
　　 方法：10例20-40歲男性骨科取內固定患者，無髖部外傷史，無心血管疾病史，無可能存在有新生血管形成狀態(tài)如腫瘤或腎病史。抽取外周血20ml，分離、培養(yǎng)并鑒定hEPCs。然后分別加入0、0.4、4、40、400及4000μg/ml強的松龍及甲基強的松龍，72

4、小時后上酶標儀450nm波長檢測，采用t檢驗分析OD值差異。將細胞分為兩組，組1分別加入0.4μg/ml強的松龍及甲基強的松龍;組2分別加入4000μg/ml強的松龍及甲基強的松龍，采用MatrixMatrigel檢測hEPCs形成新生血管，利用LeicaQ-Win圖像分析軟件分析圖像并采用t檢驗分析新生血管直徑差異。
　　 結果：強的松龍及甲基強的松龍4000μg/ml時hEPCs活性最低，甲基強的松龍組細胞活性更低，兩組比較

5、有統(tǒng)計學差異(p＜0.01);兩組在濃度為4000μg/ml時均無新生血管形成;在濃度為0.4μg/ml時，兩組均可形成新生血管，但兩組新生血管直徑有統(tǒng)計學差異，甲基強的松龍組新生血管直徑更細(p＜0.02)。
　　 結論：強的松龍及甲基強的松龍在4000μg/ml時對hEPCs活性抑制最強，但甲基強的松龍有更強抑制性且兩者之間有統(tǒng)計學差異;強的松龍及甲基強的松龍在4000μg/ml時完全抑制hEPCs形成新生血管，在0.4μg

6、/ml時兩組形成新生血管直徑有統(tǒng)計學差異，甲基強的松龍組新生血管直徑更細。
　　 第三部分、糖皮質激素相關性股骨頭壞死患者外周血hEPCs功能研究
　　 目的：觀察糖皮質激素相關性股骨頭壞死患者外周血hEPCs兩大重要功能—遷移能力和形成新生血管能力。
　　 方法：10例20-40歲通過MRI確診男性激素相關性股骨頭壞死患者，無心血管疾病史，無可能存在有新生血管形成狀態(tài)如腫瘤或腎病史。抽取外周血20ml，分離、培

7、養(yǎng)并鑒定hEPCs。然后應用NeuroProbeZigmondChamber細胞遷移板，加入基質細胞趨化因子-1α(SDF-1α，stromalcell-derivedfactor-1α)，連續(xù)拍照24小時，利用LeicaQ-Win圖像分析軟件分析圖像并采用t檢驗分析遷移距離差異。采用MatrixMatrigel檢測hEPCs形成新生血管，利用LeicaQ-Win圖像分析軟件分析圖像并采用t檢驗分析新生血管直徑差異。
　　 結果