視網膜新生血管形成時緊密連接蛋白Claudins表達的時空變化的研究.pdf

1、Claudins是近年發(fā)現的一個多基因家族，至今已發(fā)現超過24個家族成員，Claudins蛋白被認為是形成緊密連接的骨架。在不同的組織和不同的病理生理狀態(tài)下，Claudins家族成員的表達與分布有明顯變化，屏障功能相應改變，而已有的關于他們的研究主要集中在上皮組織中。新生血管生長是糖尿病視網膜病變等眼部血管性疾病的主要病理特征和嚴重并發(fā)癥，原有的血-視網膜內屏障的緊密連接的破壞和/或視網膜新生血管內皮細胞間的緊密連接屏障發(fā)育不完善引起滲

2、漏、出血、和/或水腫等，進而導致患者嚴重視力損害。迄今為止，關于Claudins在視網膜組織及病理性視網膜新生血管上的研究甚少。因此，本研究首先研究了正常小鼠視網膜中Claudins的mRNA和蛋白表達與分布，然后以氧誘導視網膜病變模型為主要方法，檢測了視網膜新生血管生成時Claudins表達的時空變化。
　　 第一部分正常小鼠視網膜組織中緊密連接蛋白Claudins的表達與分布研究
　　 目的：探討正常小鼠視網膜組織中

3、緊密連接蛋白Claudins的表達與分布特點。
　　 方法：取出生后第18天(P18)正常小鼠視網膜和6周齡成年小鼠視網膜、腎臟和腦組織提取RNA，用RT-PCR檢測緊密連接蛋白Claudins的mRNA表達水平。提取P8、11、13、15、18和21天小鼠視網膜組織RNA，實時熒光定量RT-PCR檢測視網膜發(fā)育過程中Claudins mRNA表達的動態(tài)變化。P18小鼠眼球冰凍切片免疫熒光染色檢測緊密連接蛋白Claudin-1～

4、-5，-7，-12和-23在視網膜的分布，P18小鼠免疫熒光視網膜全層鋪片檢測Claudin-1、-2和-5在視網膜深、淺層血管的表達與分布。
　　 結果：在正常P18天和6周齡成年小鼠視網膜組織中均能檢測到多種Claudins基因mRNA水平的表達。其中表達最高的是Claudin-5、-12和-23，其次是Claudin-1～-４、-7、-9、-10、-11、-19、-20和-22，與P18小鼠相比，6周齡成年小鼠中Claud

5、in-1、-2、-4、-9和-19表達降低，而Claudin-18表達增高。作為陽性對照標本的6周齡小鼠腎臟和腦組織中檢測到多種Claudins的表達，但四種組織中均未檢測到Claudin-6的表達。在正常小鼠視網膜發(fā)育過程中，mRNA表達變化超過2倍的有Claudin-1～-5、-7、-12，-14～-17，-22和-23。P18小鼠冰凍切片免疫熒光染色顯示Claudin-1、-2、-4和-5均分布在神經節(jié)細胞層(GCL)、內叢狀層(

6、IPL)和外叢狀層(OPL)，Claudin-4的分布與IsolectinB4沒有共定位，而Claudin-1、-2和-5均與IsolectinB4呈共定位分布。Claudin-3和-23僅在神經節(jié)細胞層中檢測到表達，Claudin-12僅分布在外叢狀層，Claudin-3、-12和-23均不與IsolectinB4呈共定位分布。視網膜冰凍切片免疫熒光未檢測到Claudin-7的表達。視網膜鋪片免疫熒光染色顯示P18小鼠視網膜深層淺層血

7、管網上均有Claudin-1、-2和-5的表達，呈線性均勻分布。
　　 結論：從P8至P21，伴隨視網膜的發(fā)育，Claudin-1、-2、-3、-4、-5、-12和-23的mRNA呈先增高后降低的動態(tài)表達趨勢，其中Claudin-1、-2和-5分布在視網膜深淺兩層各級血管上，對于血-視網膜內屏障功能具有重要作用，而不分布在血管上的Claudin-3、-4、-12和-23則可能對視網膜神經發(fā)育具有重要作用。
　　 第二部分

8、Claudins在氧誘導的小鼠血管增殖性視網膜病變中的差異表達
　　 目的：探討OIR小鼠視網膜新生血管形成時血-視網膜內屏障的功能狀態(tài)以及Claudins表達和分布的特點。
　　 方法：用C57BL/6J乳鼠建立氧誘導視網膜病變(OIR)模型，于出生后7天將乳鼠隨同母鼠放入含氧體積分數為75％的養(yǎng)箱中飼養(yǎng)5天，P12放回到正常大氣環(huán)境中繼續(xù)飼養(yǎng)5天。于P18行FITC-Dextran心臟灌注及伊文思藍腹腔注射視網膜鋪片

9、分別檢測OIR成模情況和OIR小鼠視網膜內屏障功能。P18行腹腔注射伊文思藍測定視網膜組織中染料含量，定量檢測視網膜內屏障功能。P8、P11、P13、P15、P18和P21提取視網膜組織RNA和蛋白，分別行實時熒光定量PCR和Western blot檢測Claudins的mRNA和蛋白表達的動態(tài)變化，P18行視網膜鋪片免疫熒光染色激光共聚焦掃描顯微鏡檢測Claudin-1、-2和-5的空間分布特點。
　　 結果：FITC-Dex

10、tran灌注視網膜鋪片顯示P18天時，OIR小鼠視網膜出現大量新生血管生成伴視乳頭周圍無灌注區(qū)形成，伊文思藍腹腔注射視網膜鋪片顯示P18天OIR小鼠視網膜中大片染料滲漏，定量檢測OIR小鼠視網膜中染料含量為(20.47±6.73)μg×μl×h×μg-1，而正常小鼠視網膜中染料含量為(1.75±1.08)μg×μl×h×μg-1，其差別具有統(tǒng)計學意義。實時熒光定量PCR檢測到Claudin-1～-4、-7、-12和-23在OIR和正常小

11、鼠視網膜中的表達存在差異；Western blot顯示在正常和OIR小鼠視網膜中，Claudin-2和-5的蛋白表達水平均呈先增高后降低的趨勢，Claudin-2和-5在P18達到高峰，與正常小鼠相比較，OIR小鼠視網膜中Claudin-1的表達在P8至P21各個時間點的差別均無統(tǒng)計學意義，Claudin-2和-5在P15、P18和P21均表現升高，其差別具有統(tǒng)計學意義。視網膜鋪片激光共聚焦顯微鏡掃描顯示正常P18小鼠視網膜血管網上這三

12、種緊密連接蛋白的分布具有一致性，它們均勻分布在各級血管上，呈線性紅色熒光圍繞血管內皮細胞邊緣，呈梭形排列，在胞漿內即網眼中偶爾可伴少量點狀染色，而在OIR小鼠視網膜中，血管內皮細胞間的緊密連接出現排列紊亂，但熒光強度反而升高，內皮細胞邊界的線性熒光連續(xù)性中斷，新生血管團中熒光在細胞內的分布特點更為明顯，網眼中的點、團狀分布的熒光強度更強。
　　 結論：Claudin-1、-2和-5在氧誘導的小鼠血管增殖性視網膜病變中新生血管內皮