四君子湯對TNBS誘導(dǎo)的UC大鼠結(jié)腸緊密連接蛋白表達的影響研究.pdf

1、背景:
　　炎癥性腸病（Inflammatory bowel disease，IBD）是指一組病因不明的非特異性腸道炎癥，包括潰瘍性結(jié)腸炎(Ulcerative colitis，UC)和克羅恩病(Crohn's disease，CD)，主要發(fā)生在結(jié)腸黏模層的炎性病變，以潰瘍糜爛為主，大部分會延伸影響到遠(yuǎn)端結(jié)腸和直腸，控制腸道黏膜屏障的炎癥在潰瘍性結(jié)腸炎病的臨床治療方面具有重要意義。該病臨床常為慢性持續(xù)、反復(fù)發(fā)作，但個別也可急劇起病

2、而呈暴發(fā)性。由于環(huán)境、個人生活習(xí)慣、飲食條件等變化，經(jīng)統(tǒng)計該病顯逐年增加的趨勢。
　　黏膜屏障是腸道最重要的一道屏障，由完整的腸上皮細(xì)胞(Intestinal epithel ialcell，IEC)和相鄰腸上皮細(xì)胞之間的連接構(gòu)成，調(diào)控著水和溶質(zhì)的跨上皮轉(zhuǎn)運（如單糖、氨基酸、核苷酸、維生素及激素等）。研究認(rèn)為，黏膜上皮細(xì)胞及其細(xì)胞間的各種連接結(jié)構(gòu)是腸道顧護外環(huán)境中有害物質(zhì)或病原體入侵的關(guān)鍵，是維持腸上皮的選擇通透性及其功能的結(jié)構(gòu)基

3、礎(chǔ)。細(xì)胞間連接方式有多種，如緊密連接(Tightjunction，TJ)、縫隙連接(Gap junction，GJ)、黏附連接(Adherence junction，AJ)以及橋粒(Desmosome)等，TJ是細(xì)胞間最重要的連接方式。腸上皮細(xì)胞(IEC) TJ一旦發(fā)生變異、減少或缺失，IEC的間隙通透性就會增加，細(xì)菌、內(nèi)毒素及大分子物質(zhì)即可通過TJ進入體循環(huán)。IBD特征就是IEC旁路通透性增高，允許腸腔內(nèi)病原菌及其毒素通過并進入上皮下

4、層，導(dǎo)致疾病的發(fā)生。因此，保護上皮屏障的緊密連接功能的完整性對防御與治療炎癥性腸病起著至關(guān)重要的作用。
　　四君子湯(SiJunzi Decoction，SJZD)出自宋代《太平惠民和劑局方》，為益氣健脾的代表方劑，臨床常用于治療脾虛證。多項臨床研究使用四君子湯單方、加減方或配合其他藥物治療潰瘍性結(jié)腸炎，療效顯著。課題組前期研究結(jié)果四君子湯可促進小腸上皮細(xì)胞增殖、遷移與抑制凋亡，具有修復(fù)胃腸道受損黏膜與免疫調(diào)節(jié)的作用。由此，我們提

5、出工作假設(shè):四君子湯治療UC可能與影響腸道上皮緊密連接(TJ)蛋白表達有關(guān)。
　　目的:
　　建立大鼠實驗性潰瘍性結(jié)腸炎(UC)模型，以及體外腸道上皮屏障受損細(xì)胞模型，考察SJZD對腸道緊密連接蛋白表達的影響，探討SJZD通過影響緊密連接蛋白表達，修復(fù)腸道黏膜屏障，治療UC大鼠的分子機制，及其對NF-κB信號通路蛋白表達的影響。
　　方法:
　　體內(nèi)實驗:
　　1.TNBS誘導(dǎo)的SD大鼠UC模型建立

6、　　將動物稱重編號后，隨機區(qū)組法分為正常組(n=6)、TNBS50mg/kg(n=6)組、TNBS100mg/kg(n=6)組、TNBS150mg/kg(n=6)組。造模24h后，每天灌胃給予無菌水一次(10mL/kg)，觀察大鼠體重、飲食、精神狀態(tài)和糞便情況，給予DAI評分，連續(xù)10天。取大鼠血清和結(jié)腸，給予CMDI評分，并取病變結(jié)腸做病理切片HE染色進行觀察，給予TDI評分，綜合選取合適的造模條件。
　　2.四君子湯對UC大鼠

7、的治療效果觀察
　　于造模后第二天開始灌胃給予四君子湯，實驗設(shè)正常組、TNBS造模組、SASP陽性對照組、四君子湯復(fù)方給藥組（含低、中、高劑量）10天。觀察大鼠飲食、精神狀態(tài)、體重、大便性狀與隱血評分、大便次數(shù)與重量等情況，給予DAI評分。末次給藥后禁食24h，腹主動脈收集大鼠血清。處死動物取結(jié)腸部分，肉眼觀察結(jié)腸黏膜的病變并進行結(jié)腸大體形態(tài)損傷評分(CMDI)，取病變部位進行HE染色，光鏡下評價黏膜病理學(xué)損傷指數(shù)(TDI)，分析

8、四君子湯對TNBS誘導(dǎo)的SD大鼠潰瘍性結(jié)腸炎的治療作用情況。
　　3.四君子湯對UC大鼠結(jié)腸緊密連接mRNA和蛋白表達的影響
　　采用RT-PCR法檢測大鼠病變結(jié)腸組織緊密連接蛋白occludin、claudin-2基因表達，并采用免疫組化法分析大鼠結(jié)腸中緊密連接蛋白occludin、claudin-2的表達影響，計算各組平均光密度。
　　4.四君子湯對UC大鼠結(jié)腸炎癥因子mRNA表達與血清中炎癥因子分泌的影響

9、　　采用Real-Time PCR法檢測四君子湯治療后大鼠結(jié)腸中炎癥因子IL-6、TNF-a、IFN-γ、 IL-1βmRNA表達，并使用Elisa法檢測大鼠血清中IL-6、TNF-a、IFN-γ、IL-1β、小腸三葉肽TFF-3的含量。
　　體外實驗:
　　1.TNBS誘導(dǎo)的人結(jié)腸癌Caco-2細(xì)胞損傷模型建立
　　使用不同濃度TNBS溶液（200μg/mL、300μg/mL、400μg/mL、500μg/mL）損傷

10、Caco-2細(xì)胞不同時間(4h、6h、12h、24h、48h)制作Caco-2細(xì)胞炎癥模型，MTT法檢測細(xì)胞活力，確定合適的TNBS造模濃度與損傷時間。
　　2.SJZD總多糖中的多糖含量測定與簡單質(zhì)量控制
　　使用硫酸苯酚法測定SJZD總多糖中多糖的含量，并對SJZD總多糖的穩(wěn)定性進行考察。另外，采用BCA法檢測了總多糖中蛋白質(zhì)的含量。
　　3.SJZD總多糖對Caco-2損傷模型的生長保護作用
　　細(xì)胞經(jīng)TN

11、BS損傷造模之后，給予不同濃度SJZD總多糖(70μg/mL-200μg/mL)治療，給藥不同時間(24h、36h、48h)，MTT法檢測細(xì)胞活力，評價SJZD總多糖最佳給藥濃度。
　　4.四君子湯總多糖對TNBS損傷Caco-2細(xì)胞緊密連接蛋白的影響
　　實驗設(shè)正常組、模型組、總多糖給藥組，同時設(shè)定不同給藥時間(包括24h、36h、48h)，RT-PCR法檢測緊密連接蛋白claudin-1，2，4、ZO-1，2，3、occ

12、ludin、E-cad、JAM mRNA的表達，并采用Western-blot法檢測claudin-1、occludin與ZO-3，蛋白表達的情況。
　　5.四君子湯總多糖對TNBS損傷Caco-2細(xì)胞NF-κB通路的影響
　　實驗分正常組、模型組、總多糖給藥組，給藥時間設(shè)6、9、12h。提取給藥后的細(xì)胞核蛋白，分別使用NF-κB p50/p65 Tanscription Factor Assay Kit和Western-B

13、lot法檢測核蛋白中NF-κB的表達。
　　結(jié)果:
　　體內(nèi)實驗:
　　1.50mg/kg-150mg/kg TNBS均可誘導(dǎo)SD大鼠結(jié)腸出現(xiàn)黏膜損傷，制備出潰瘍性結(jié)腸炎病理模型，模型可持續(xù)10天以上，其中以TNBS100mg/kg、150mg/kg的結(jié)腸損傷作用更加顯著。從模型穩(wěn)定性與造模成本等因素上考慮，我們選用TNBS100mg/kg作為體內(nèi)研究造模劑量。
　　2.四君子湯可降低TNBS誘導(dǎo)的UC大鼠DAI

14、、CDMI、TDI評分值。HE染色結(jié)果表明SJZD具有修復(fù)損傷黏膜的作用，其中以中高劑量組（生藥量5.6 g/kg）的治療效果最明顯。
　　3.大鼠結(jié)腸緊密連接蛋白occludin與claudin-2主要分布在上皮細(xì)胞之間，TNBS誘導(dǎo)可降低大鼠結(jié)腸組織occludin、claudin-2mRNA的表達，同時可使occludin與claudin-2蛋白表達量降低。SJZD中高劑量組(生藥量2.8 g/kg，5.6 g/kg)可顯著

15、性恢復(fù)大鼠結(jié)腸緊密連接蛋白的表達。
　　4.模型組大鼠結(jié)腸組織中的TNF-α、IFN-γ、 IL-6 mRNA表達較對照組顯上升的趨勢，四君子湯中高劑量（生藥量2.8 g/kg，5.6 g/kg）組可降低結(jié)腸中TNF-α、IFN-γ mRNA表達，低中高劑量(生藥量1.4g/kg，2.8 g/kg，5.6 g/kg)對IL-6 mRNA表達均有下調(diào)作用。模型組大鼠血清中TNF-α、IFN-γ、IL-6、IL-1β含量較對照組均升高

16、，IL-1β的升高值具有顯著性差別(P＜0.05)，小腸三葉因子TFF-3表達下降。四君子湯可降低大鼠血清中炎癥因子TNF-α、IFN-γ、IL-6、IL-1β的含量，升高小腸三葉因子TFF-3的含量。
　　體外實驗:
　　1.不同濃度TNBS對Caco-2細(xì)胞均有一定的活力抑制作用，并呈一定的劑量和時間依賴性。我們選擇TNBS200μg/mL的濃度損傷細(xì)胞24h作為造模條件，結(jié)果表明可造成穩(wěn)定的細(xì)胞損傷模型。
　　2

17、.四君子湯總多糖的多糖含量約為70％，一年內(nèi)多糖含量穩(wěn)定。蛋白質(zhì)含量約為20％。
　　3.四君子湯總多糖濃度在100-150μg/mL之間對受損的Caco-2細(xì)胞均有修復(fù)作用，其中以120μg/mL作用最顯著。
　　4.四君子湯總多糖給藥24、36、48h內(nèi)對受損Caco-2細(xì)胞緊密連接蛋白claudin-1，2，4、ZO-1，2，3、occludin、E-cad mRNA表達有上調(diào)作用，其中以ZO-3、occludin、c

18、laudin-1較為明顯。對緊密連接蛋白JAM mRNA影響不明顯。同時，SJZD總多糖可上調(diào)受損細(xì)胞ZO-3、occludin、claudin-1蛋白表達。
　　5.TNBS造模后Caco-2細(xì)胞細(xì)胞核中NF-κB含量升高，四君子湯總多糖給藥9h可下調(diào)損傷后的Caco-2細(xì)胞細(xì)胞核中NF-κB的含量，結(jié)果與模型組比較具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。
　　結(jié)論:
　　四君子湯通過影響結(jié)腸上皮細(xì)胞黏膜的緊密連接蛋白表達，