Ang-Tie2通路在內(nèi)皮細(xì)胞通透性增高中的作用研究.pdf

1、目的：長期使用非生理性腹膜透析（腹透）液引起腹膜轉(zhuǎn)運(yùn)增高，導(dǎo)致腹膜超濾減少，是患者退出腹透的主要原因之一，然而其具體機(jī)制目前尚不清楚。血管生成素（Angiopoietin，Ang）及其受體 Tie2系統(tǒng)是參與調(diào)控血管通透性的重要因子，本研究從內(nèi)皮細(xì)胞通透性的角度，采用體外培養(yǎng)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞，觀察高濃度葡萄糖和葡萄糖降解產(chǎn)物甲基乙二醛對內(nèi)皮細(xì)胞通透性和連接蛋白表達(dá)的影響，研究高濃度葡萄糖和甲基乙二醛對內(nèi)皮細(xì)胞Ang2/Tie2信號表達(dá)的

2、影響，并進(jìn)一步采用COMP-Ang1——人工合成的Ang1擬似物——與 Ang2競爭性結(jié)合Tie2受體，研究其對內(nèi)皮細(xì)胞連接蛋白的表達(dá)和通透性的影響，以探討Ang2/Tie2信號在腹膜血管通透性增高中的作用。
　　方法：本研究采用體外培養(yǎng)的人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞株 EA.hy926，分為以下四組：對照組，2.5％葡萄糖組，2.5%甘露醇組及200μM甲基乙二醛組，檢測內(nèi)皮細(xì)胞對 FITC-BSA的通透性，采用Western Blot法檢

3、測內(nèi)皮細(xì)胞對連接蛋白 VE-cadherin、Occludin及Claudin-5的表達(dá)；采用Real-time PCR法檢測內(nèi)皮細(xì)胞Ang2和Tie2的表達(dá)，采用Western Blot檢測內(nèi)皮細(xì)胞 Ang2和Tie2的表達(dá)；采用COMP-Ang1競爭性和Ang2結(jié)合Tie2受體，檢測其對內(nèi)皮細(xì)胞通透性和連接蛋白表達(dá)的影響。
　　結(jié)果：
　　1.2.5%葡萄糖、2.5%甘露醇及200μM甲基乙二醛刺激12h后，與對照組相比

4、，2.5%葡萄糖（1.566±0.156 vs.1，P=0.024），2.5%甘露醇（1.438±0.090 vs.1，P=0.014）及200μM甲基乙二醛（1.482±0.135 vs.1，P=0.003）可以明顯增加內(nèi)皮細(xì)胞對FITC-BSA的通透性。2.5%葡萄糖組（0.097±0.015 vs.0.349±0.052，P=0.001），2.5%甘露醇組（0.125±0.028 vs.0.349±0.052，P=0.003）及甲

5、基乙二醛組（0.142±0.024 vs.0.349±0.052，P=0.003）內(nèi)皮細(xì)胞連結(jié)蛋白VE-cadherin的蛋白表達(dá)較對照組明顯降低；2.5%葡萄糖組（0.768±0.227 vs.1.274±0.100，P=0.024），2.5%甘露醇組（0.789±0.110 vs.1.274±0.100，P=0.005）及甲基乙二醛組（0.826±0.110 vs.1.274±0.100，P=0.006）的內(nèi)皮細(xì)胞緊密連接蛋白Occ

6、ludin的蛋白表達(dá)較對照組明顯降低；2.5%葡萄糖組（0.171±0.028 vs.0.313±0.047，P=0.011），2.5%甘露醇組（0.195±0.034 vs.0.313±0.047，P=0.025）的內(nèi)皮細(xì)胞緊密連接蛋白Claudin-5的蛋白表達(dá)較對照組明顯降低。
　　2.2.5%葡萄糖、2.5%甘露醇及200μM甲基乙二醛刺激12h后，2.5%葡萄糖組（1.739±0.348 vs.1，P=0.021）及甲基

7、乙二醛組（1.389±0.239 vs.1，P=0.048）的內(nèi)皮細(xì)胞 Ang2 mRNA表達(dá)較對照組明顯增加。甲基乙二醛組的內(nèi)皮細(xì)胞 Tie2 mRNA表達(dá)較對照組明顯增加（1.231±0.059 vs.1，P=0.048）。2.5%葡萄糖組（0.995±0.113 vs.0.663±0.041，P=0.009）、2.5%甘露醇組（0.900±0.129 vs.0.663±0.041，P=0.038）及甲基乙二醛組（0.886±0.0

8、84 vs.0.663±0.041，P=0.015）的內(nèi)皮細(xì)胞 Ang2蛋白表達(dá)較對照組明顯增加;甲基乙二醛組的內(nèi)皮細(xì)胞 Tie2蛋白表達(dá)較對照組明顯增加（0.737±0.090 vs.0.54±0.114，P=0.023）。
　　3.與2.5%葡萄糖組相比，2.5%葡萄糖+COMP-Ang干預(yù)組的內(nèi)皮細(xì)胞對FITC-BSA的通透性明顯降低（1.235±0.119 vs.1.566±0.156，P=0.027），且對VE-cadh

9、erin（0.225±0.044 vs.0.097±0.015，P=0.032）、Claudin-5（0.605±0.038 vs.0.467±0.044，P=0.008）和Occludin（1.133±0.069 vs.0.768±0.227，P=0.024）的蛋白表達(dá)明顯增加；與2.5%甘露醇組相比，2.5%甘露醇+COMP-Ang干預(yù)組的內(nèi)皮細(xì)胞對FITC-BSA的通透性明顯降低（1.213±0.095 vs.1.438±0.09

10、0，P=0.018），且對VE-cadherin（0.313±0.054 vs.0.125±0.028，P=0.006）、Claudin-5（0.646±0.066 vs.0.423±0.064，P=0.016）和Occludin（1.055±0.084 vs.0.809±0.100，P=0.031）的蛋白表達(dá)明顯增加；與200μM甲基乙二醇組相比，200μM甲基乙二醇+COMP-Ang干預(yù)組的內(nèi)皮細(xì)胞對FITC-BSA的通透性明顯降低

11、（1.216±0.079 vs.1.482±0.135，P=0.009），且對VE-cadherin（0.237±0.032 vs.0.142±0.024，P=0.021）、Claudin-5（0.751±0.051 vs.0.561±0.100，P=0.046）和Occludin（1.056±0.078 vs.0.826±0.110，P=0.042）的蛋白表達(dá)明顯增加。
　　結(jié)論：高濃度葡萄糖和甲基乙二醇可能通過Ang2/Tie