褪黑素對IL-1β誘導的人臍靜脈內皮細胞通透性的影響.pdf

1、目的:
　　 第二部分:為了探討褪黑素(MEL)對血管單層內皮細胞屏障的保護作用,以培養(yǎng)在Transwell系統(tǒng)內的單層人臍靜脈內皮細胞(HUVECs)為模型,觀察MEL對IL-1β誘導的單層內皮細胞通透性的影響。
　　 第三部分:觀察MEL對IL-1β誘導的HUVECs間黏附連接和細胞骨架的影響。
　　 第三部分:探討MEL對單層內皮細胞屏障保護作用可能的受體途徑和信號通路。
　　 方法:
　　

2、 第二部分:原代分離培養(yǎng)HUVECs,并使用包被小鼠抗人CD31單克隆抗體的免疫磁珠對原代分離的HUVECs進一步純化。以小鼠抗人vWF單克隆抗體及FITC標記的山羊抗小鼠熒光二抗鑒定純化后的HUVECs。將純化后的HUVECs接種在Transwell系統(tǒng),通過檢測不同干預條件下透過單層內皮的熒光標記的葡聚糖來反映內皮通透性的改變。
　　 第三部分:用免疫熒光顯微鏡和激光共聚焦顯微鏡觀察不同干預條件下內皮細胞黏附連接蛋白VE鈣粘

3、素(VE-cadhedn)和細胞骨架蛋白的變化情況。使用Westernblot檢測VE-cadherin的表達變化情況。
　　 第三部分:檢測MEL和IL-1β對影響內皮細胞間連接和細胞骨架的重要的信號通路Rho GTPase家族中Rac蛋白的影響；應用MEL受體阻滯劑Luz、Rac的抑制劑NSC-23766,探討MEL發(fā)揮HUVECs屏障保護作用的受體途徑和信號通路。
　　 結果:
　　 第二部分:(1)成功分

4、離培養(yǎng)原代HUECs,免疫磁珠篩選后能繼續(xù)貼壁生長并傳代,倒置顯微鏡下HUVECs呈鵝卵石狀,vWF免疫熒光染色證實細胞確為HUVECs。細胞呈梭形、圓形或多角形。(2)與空白對照組相比,5、10和20ng/mL的IL-1β分別使HUVECs通透性由1.5±0.1升高為4.8±0.3、5.2±0.4和9.8±0.8(P<0.01)；10和100μ mol/L的MEL分別使10ng/mL的IL-1β誘導的通透性從5.2±0.4降至2.8±

5、0.3和2.7±0.3(P<0.01).此結果與“時間-過程”通透性實驗結果一致。
　　 第二部分:(1)熒光顯微鏡觀察:正常融合后的內皮細胞表達VE-cadherin呈現(xiàn)出連續(xù)不間斷的狀態(tài)；IL-1β(10ng/ml)破壞了細胞間的黏附連接,使VE-cadherin在細胞膜上的表達下調,并出現(xiàn)斷裂。MEL(10μmol/L)預處理后,VE—cadherin的表達狀態(tài)得到了改善。(2)激光共聚焦顯微鏡下觀察:IL-1β(10ng

6、/ml)明顯的破壞了細胞間的黏附連接,使正常狀態(tài)下分布在細胞邊緣的肌動蛋白轉變?yōu)榭缂毎w的應力纖維,原本融合的細胞間出現(xiàn)明顯的縫隙。MEL(10μmol/L)預處理后,沒有出現(xiàn)明顯的黏附連破壞現(xiàn)象,細胞中心應力纖維的表達減少,邊緣部位的肌動蛋白增加,細胞間縫隙變小。(3)Western Blot結果表明:與對照組相比,IL-1β使HUVECs的VE-cadherin表達量下調。MEL可抑制IL-1β誘導的VE-cadherin下調,但仍

7、低于對照組。
　　 第三部分:(1)Luz阻斷了MEL對內皮屏障的保護作用；阻斷了MEL對內皮黏附連接和細胞骨架的影響,導致細胞連接破壞和應力纖維增加,細胞間出現(xiàn)縫隙。(2)MEL預處理抑制了IL-1β誘導的Rac的失活,而Luz可以阻斷MEL的這種作用。(3)NSC-23766抑制了MEL對內皮屏障的保護作用。
　　 結論:(1)IL-1β誘導HUVECs黏附連接蛋白VE-cadherin表達降低,應力纖維增加,細胞間