螺內(nèi)酯對醛固酮誘導(dǎo)的人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞LOX-1 mRNA表達(dá)的影響.pdf

1、目的:通過體外培養(yǎng)臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞,給予藥物(螺內(nèi)酯)及 LOX-1化學(xué)拮抗劑(聚肌苷酸)作用,并加以醛固酮誘導(dǎo),觀察藥物組、化學(xué)拮抗劑組及陰性對照組、陽性對照組之間血凝素樣氧化低密度脂蛋白受體-1(LOX-1)的mRNA表達(dá)的差異,從而證明醛固酮拮抗劑螺內(nèi)酯對臍靜脈內(nèi)皮LOX-1基因表達(dá)的影響,并進(jìn)一步探討這種作用對于某些心血管疾病可能的預(yù)防及延緩作用。
　　方法:實驗于2011年5月至2011年10月在安徽醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院中

2、心實驗室完成。①購買臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞株,HUVECs(ECV304)購自南京凱基生物公司,在中心實驗室常規(guī)傳代培養(yǎng)。用凱基-1640培養(yǎng)基+20％胎牛血清(南美HYCLON公司),37℃、5%CO2條件培養(yǎng)。待細(xì)胞生長成單層達(dá)90%培養(yǎng)面積后,用0.25%胰酶消化液消化、傳代、凍存。2~5代HUVECs用于實驗。②將培養(yǎng)細(xì)胞分別按細(xì)胞處理方式不同分為6組陰性對照組:普通1640培養(yǎng)基(A組);不同濃度ALD組:分別加入不同濃度ALD(10

3、、100、1000 nmol/L,分別為B、C、D組);ALD+PolyI組(E組):先用Poly I(250 mg/L)預(yù)先處理2 h后再以1000 nmol/L ALD共同培養(yǎng)24 h;ALD+Spiro組(F組)用1000 nmol/L ALD+1μmol/L Spiro二者共培養(yǎng)24h,③用2~5代HUVECs以2×104接種于24孔板,培養(yǎng)約48 h左右待細(xì)胞匯集成單層達(dá)80%培養(yǎng)面積,換無血清1640培養(yǎng)基饑餓培養(yǎng)12 h后

4、按不同分組及方法加藥,各組細(xì)胞與藥物共培養(yǎng)24 h后收獲細(xì)胞④藥物作用24 h后收集細(xì)胞,用Trizol試劑提取細(xì)胞總RNA,采用RT-PCR檢測每組細(xì)胞LOX-1 mRNA的含量。RT-PCR結(jié)果通過凝膠成像處理系統(tǒng)做積分吸光度測定和分析,以各組目的基因擴(kuò)增條帶的吸光度值與內(nèi)參β-actin條帶的吸光度值之比作為目標(biāo)mRNA的表達(dá)量。
　　結(jié)果:①實驗重復(fù)三次,體外培養(yǎng)的臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞存活良好,以0.4%的臺盼蘭染液染色后計數(shù),

5、細(xì)胞存活率約為96%-98%。②與陰性對照組比較一定濃度醛固酮可以明顯上調(diào)臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞表面LOX-1mRNA的表達(dá)P<0.05差異有統(tǒng)計學(xué)意義。③醛固酮在一定的濃度范圍內(nèi)呈劑量依耐性上調(diào)體外培養(yǎng)的臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞LOX-1mRNA表達(dá),即LOX-1mRNA表達(dá)量B