P190通過調(diào)控GEF-H1的表達和磷酸化修飾影響腦微血管內(nèi)皮細胞通透性Visfatin通過上調(diào)CCL2表達促進小細胞肺癌細胞跨腦微血管內(nèi)皮細胞遷移.pdf

1、目的：
　　血腦屏障(blood brain-barrier，BBB)主要由腦血管內(nèi)皮細胞與內(nèi)皮細胞間緊密連接(tight junctions，TJs)構(gòu)成，其可以有效阻止大分子物質(zhì)的自由通過，對維持中樞神經(jīng)系統(tǒng)(CNS)內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定起決定性作用，其中TJs是維持BBB功能的最關(guān)鍵結(jié)構(gòu)之一。TJs由跨膜蛋白(occludin等)、胞漿附著蛋白(ZO-1等)與細胞骨架蛋白相連而組成。TJs蛋白表達量的改變，位置分布的變化以及結(jié)構(gòu)功能的

2、異常均可能破壞TJs的完整性，引起細胞間連接的開放，導致BBB通透性的改變。
　　在CNS中，少突膠質(zhì)細胞發(fā)出多個突起，隨后在軸突上形成髓鞘。髓鞘并不是始終連續(xù)，每隔一定長度有間斷，髓鞘的間斷處稱朗飛氏節(jié)（ranvier node），節(jié)間體近朗飛氏節(jié)的部分稱節(jié)側(cè)區(qū)（paranode）。節(jié)側(cè)區(qū)主要聚集的分子是P190，contactin，神經(jīng)束蛋白155(neurofascin)。P190蛋白是一種神經(jīng)元單次跨膜蛋白，由1384個氨

3、基酸組成，其N端在胞外，C端位于胞內(nèi)。最初發(fā)現(xiàn)于有髓神經(jīng)纖維郎飛氏節(jié)的節(jié)旁側(cè)的神經(jīng)軸突細胞膜上，與髓鞘形成細胞（少突膠質(zhì)細胞或施旺細胞）膜上的配體形成復合體，維持神經(jīng)沖動跳躍式傳導、神經(jīng)軸突-膠質(zhì)細胞間信息傳遞以及軸突特化區(qū)域的形成。研究表明，P190表達異常可產(chǎn)生嚴重的神經(jīng)系統(tǒng)功能紊亂，表現(xiàn)出震顫，運動失調(diào)以及顯著的麻痹性癱瘓。在先天性多關(guān)節(jié)攣縮癥患者中發(fā)現(xiàn)P190基因發(fā)生突變。P190表達降低進一步導致髓鞘脫離軸突，促進軸突變性壞死

4、，進而形成神經(jīng)元變性損傷的惡性循環(huán)。因此，P190功能的研究對相關(guān)疾病的發(fā)病機理與防治策略具有重要意義。
　　鳥苷酸交換因子(GEF-H1)是Rho家族的小GTPase，能夠維持微管的動態(tài)平衡。當GEF-H1結(jié)合在微管上時，處于失活狀態(tài);而從微管上釋放后，處于活化狀態(tài)?；罨腉EF-H1可誘導應力纖維的產(chǎn)生以及RhoA和Rac的活化。GEF-H1在許多細胞中發(fā)揮重要的功能，包括參與胞質(zhì)分裂，細胞生長，細胞遷移，調(diào)節(jié)上皮和內(nèi)皮的屏障

5、以及信號轉(zhuǎn)導等。在乳腺癌、肺癌、胰腺癌，胃癌，卵巢癌等腫瘤細胞中，均發(fā)現(xiàn)GEF-H1表達異常。有研究表明，激酶PAK可使GEF-H1發(fā)生磷酸化，導致肺的內(nèi)皮細胞通透性升高，造成肺損傷。但GEF-H1在人腦微血管內(nèi)皮細胞(HBMEC)中的功能還尚不清楚。
　　我們實驗室前期結(jié)果發(fā)現(xiàn)，P190在小鼠腦微血管內(nèi)皮中特異表達;P190胞內(nèi)段缺失可引起HBMEC單層通透性增加;基因芯片檢測到P190胞內(nèi)段缺失后，GEF-H1表達降低?；谝?/p>

6、上結(jié)果，本研究著重于P190胞內(nèi)段缺失引起GEF-H1表達降低的機制，P190介導GEF-H1分子功能的研究以及兩者對血腦屏障結(jié)構(gòu)和通透性的影響。
　　方法：
　　一、P190胞內(nèi)段缺失影響GEF-H1的表達以及GEF-H1表達缺失對HBMEC單層通透性的影響
　　1、Real-time PCR和western blot分別檢測P190胞內(nèi)段缺失對GEF-H1表達的影響。
　　2、構(gòu)建GEF-H1穩(wěn)定干擾細胞系，

7、利用HRP通透性實驗，檢測干擾GEF-H1后，HBMEC單層通透性的改變。
　　二、P190胞內(nèi)段缺失影響GEF-H1表達的機制
　　1、構(gòu)建pGL3-basic-GEF-H1啟動子全長及不同缺失突變的重組質(zhì)粒。
　　2、熒光素酶報告基因?qū)嶒灆z測P190胞內(nèi)段缺失或高表達P190對GEF-H1啟動子活性的影響，以及通過不同缺失突變的GEF-H1啟動子活性變化確定P190調(diào)節(jié)的GEF-H1基因調(diào)控區(qū)。
　　3、生物

8、信息學初步分析與GEF-H1啟動子基因調(diào)控區(qū)可能結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子。
　　4、干擾不同轉(zhuǎn)錄因子，real-time PCR檢測GEF-H1的表達情況，初步篩選調(diào)控GEF-H1表達的轉(zhuǎn)錄因子。
　　5、染色質(zhì)免疫共沉淀實驗驗證相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子與GEF-H1的互作關(guān)系。
　　6、Western blot檢測GEF-H1表達下調(diào)對粘附連接蛋白和緊密連接蛋白表達的影響。
　　三、P190和GEF-H1互作對GEF-H1功能以及血腦

9、屏障結(jié)構(gòu)和通透性的影響
　　1、分別在HBMEC和COS7中，通過免疫共沉淀方法驗證P190和GEF-H1的互作關(guān)系。
　　2、免疫共沉淀、Western blot實驗檢測P190胞內(nèi)段缺失或高表達P190對GEF-H1磷酸化的影響。
　　3、構(gòu)建GEF-H1絲氨酸突變位點的重組質(zhì)粒，尋找P190影響GEF-H1磷酸化的絲氨酸位點。
　　結(jié)果：
　　一、P190胞內(nèi)段缺失影響GEF-H1的表達以及GEF-H

10、1表達缺失對HBMEC單層通透性的影響
　　1、Real-time PCR和western blot結(jié)果顯示P190胞內(nèi)段缺失后GEF-H1表達降低。
　　2、HRP通透性實驗結(jié)果表明GEF-H1干擾的細胞株與對照組相比，HBMEC單層通透性升高。
　　二、P190胞內(nèi)段缺失影響GEF-H1表達的機制
　　1、構(gòu)建pGL3-basic-GEF-H1啟動子全長及不同缺失突變的重組質(zhì)粒。
　　2、熒光素酶報告基

11、因?qū)嶒灆z測P190胞內(nèi)段缺失后，GEF-H1啟動子活性被抑制，而高表達P190后，GEF-H1啟動子活性增加;GEF-H1啟動子-154-+98序列為P190調(diào)控的核心區(qū)域。
　　3、生物信息學初步分析與GEF-H1啟動子-154-+98區(qū)域可能結(jié)合的轉(zhuǎn)錄因子有Egr-1，TRA1，WT1，K-2A，ETF。
　　4、干擾轉(zhuǎn)錄因子Egr-1、TRA1、WT1、K-2A、ETF，real-time PCR檢測到影響GEF-H1

12、表達的轉(zhuǎn)錄因子有Egr-1，TRA1，WT1。
　　5、染色質(zhì)免疫共沉淀實驗表明，TRA1參與P190調(diào)控GEF-H1的表達;而Egr-1和WT1對GEF-H1的轉(zhuǎn)錄調(diào)控無明顯變化。
　　6、Western blot實驗表明，GEF-H1表達下調(diào)可導致粘附連接蛋白VE-cadherin表達降低以及緊密連接蛋白occludin和claudin5表達降低。
　　三、P190和GEF-H1互作對GEF-H1功能以及血腦屏障結(jié)

13、構(gòu)和通透性的影響
　　1、分別在HBMEC和COS7中進行免疫共沉淀，結(jié)果顯示P190和GEF-H1互作。
　　2、免疫共沉淀、Western blot實驗檢測到P190胞內(nèi)段缺失可使GEF-H1絲氨酸磷酸化升高;而高表達P190，GEF-H1絲氨酸磷酸化被抑制。
　　結(jié)論：
　　P190胞內(nèi)段缺失后，一方面，通過調(diào)節(jié)TRA1抑制GEF-H1轉(zhuǎn)錄，影響緊密連接蛋白表達，進而破壞內(nèi)皮緊密連接通透性;另一方面，通過活