內(nèi)皮素-1小干擾RNA抑制醛固酮誘導(dǎo)的心肌纖維化.pdf

1、目的:心血管疾病的發(fā)病率和死亡率居世界首位，全世界每年大約有1700萬人死于心血管疾病。心肌纖維化(myocardial fibrosis)是慢性心血管疾病的關(guān)鍵病理特征，心肌纖維化可引起心力衰竭、惡性心律失常和心源性猝死等，其嚴(yán)重程度和疾病的發(fā)展及預(yù)后密切相關(guān)。因此，研究心肌纖維化的發(fā)病機制、研發(fā)療效理想的抗心肌纖維化藥物，對于提高患者生存率、降低死亡率具有十分重要的意義。
　　心肌纖維化是指各種原因?qū)е碌男募￠g質(zhì)心臟成纖維細胞

2、增殖和細胞外基質(zhì)沉積。心臟成纖維細胞(cardiac fibroblast)異常增殖及過度合成和分泌大量膠原蛋白是心肌纖維化形成的細胞學(xué)本質(zhì)。所以，研究心臟成纖維細胞的變化對于探索心肌纖維化的發(fā)生機理及防治有著非常重要的現(xiàn)實意義。
　　心肌纖維化的發(fā)病機制復(fù)雜，目前確切的發(fā)病機制并不十分清楚，但細胞因子在其中的作用日益受到關(guān)注。如轉(zhuǎn)化生長因子-β1(transforminggrowth factor-β1，TGF-β1)和結(jié)締組織

3、生長因子等。內(nèi)皮素-1(endothelin-1，ET-1)是機體重要的細胞因子之一，能以自分泌和旁分泌方式調(diào)節(jié)局部血管緊張度，同時是一種長效、有力的促有絲分裂劑，可促進細胞增殖，從而可能在心肌纖維化的發(fā)生發(fā)展過程中起作用。近年來研究顯示，醛固酮(aldosterone，Ald)在心肌纖維化中亦有重要的作用。因此，本實驗探討ET-1在Ald誘導(dǎo)的心肌纖維化中的作用。
　　小干擾RNA(small interfering RNA，s

4、iRNA)可特異沉寂目的基因從而調(diào)節(jié)目的蛋白表達，具有高效、特異和低毒的特點。近年來，siRNA技術(shù)迅速發(fā)展為研究基因功能、疾病機制和疾病防治等領(lǐng)域的重要工具。Shyu等人在離體心肌纖維化模型中利用siRNA，發(fā)現(xiàn)UrotensinⅡ是缺氧狀態(tài)下血管緊張素Ⅱ(angiotensinⅡ，AngⅡ)誘導(dǎo)心臟成纖維細胞心肌纖維化的一個重要介質(zhì)。同時有研究表明在持續(xù)肺動脈高壓模型的肺動脈內(nèi)皮細胞，給予ET-1 siRNA處理后能增加管腔形成，并

5、降低Rho激酶活性。上述的研究為ET-1 siRNA在心肌纖維化模型心臟成纖維細胞中的應(yīng)用奠定了一定的實驗基礎(chǔ)。
　　因此，本實驗在Ald誘導(dǎo)的心肌纖維化細胞模型中應(yīng)用ET-1 siRNA轉(zhuǎn)染心臟成纖維細胞，以探討ET-1在Ald誘導(dǎo)的心肌纖維化中的作用，為臨床上心肌纖維化的發(fā)病機制和防治研究提供新的線索和依據(jù)。
　　實驗分組及方法:
　　1大鼠心臟成纖維細胞siRNA的轉(zhuǎn)染效率和持續(xù)時間
　　應(yīng)用Lipofec

6、tamineTM RNAiMAX轉(zhuǎn)染試劑和綠色熒光素標(biāo)記的不同濃度的siRNA轉(zhuǎn)染心臟成纖維細胞，觀察細胞的轉(zhuǎn)染效率和轉(zhuǎn)染持續(xù)時間，以確定最佳的siRNA轉(zhuǎn)染濃度和時間，為下一步ET-1 siRNA的轉(zhuǎn)染提供實驗依據(jù)。無菌條件下開胸剪取SD大鼠心室，用胰蛋白酶消化法和差速貼壁法獲得心臟成纖維細胞。試驗采用3-4代心臟成纖維細胞，隨機分為以下6組:
　　(1)空白對照組(n=6):細胞僅加入培養(yǎng)基Opti-MEM(@)I。
　

7、　(2) LipofectamineTM RNAiMAX轉(zhuǎn)染試劑組(n=6):細胞加入培養(yǎng)基Opti-MEM(@)I和LipofectamineTM RNAiMAX轉(zhuǎn)染試劑。
　　(3)12.5nmol/L siRNA轉(zhuǎn)染組(n=6):細胞加入培養(yǎng)基Opti-MEM(@)I，以及LipofectamineTM RNAiMAX轉(zhuǎn)染試劑和綠色熒光素標(biāo)記的siRNA(Block-iT)12.5nmol/L。
　　(4)25nmol

8、/L siRNA轉(zhuǎn)染組(n=6):細胞加入培養(yǎng)基Opti-MEM(@)I，以及LipofectamineTM RNAiMAX轉(zhuǎn)染試劑和綠色熒光素標(biāo)記的siRNA25nmol/L。
　　(5)50nmol/L siRNA轉(zhuǎn)染組(n=6):細胞加入培養(yǎng)基Opti-MEM(@)I，以及LipofectamineTM RNAiMAX轉(zhuǎn)染試劑和綠色熒光素標(biāo)記的siRNA50nmol/L。
　　(6)100nmol/LsiRNA轉(zhuǎn)染組(

9、n=6):細胞加入培養(yǎng)基Opti-MEM(@)I，以及LipofectamineTM RNAiMAX轉(zhuǎn)染試劑和綠色熒光素標(biāo)記的siRNA100nmol/L。
　　在熒光倒置顯微鏡下進行明場和熒光對照觀察不同siRNA轉(zhuǎn)染濃度（12.5nmol/L，25nmol/L，50nmol/L和100nmol/L）和不同轉(zhuǎn)染時間(6h，12h，24h，48h和72h)時細胞的綠色熒光強度和熒光表達率，從而評價siRNA在心臟成纖維細胞的轉(zhuǎn)染效

10、率和轉(zhuǎn)染持續(xù)時間。用JEDA-801D形態(tài)學(xué)圖像分析系統(tǒng)計算轉(zhuǎn)染細胞中綠色熒光蛋白的積分光密度值。
　　2 ET-1 siRNA抑制Ald誘導(dǎo)的心肌纖維化
　　在Ald誘導(dǎo)的心肌纖維化細胞模型中應(yīng)用ET-1 siRNA轉(zhuǎn)染心臟成纖維細胞，以探討ET-1在Ald誘導(dǎo)的心肌纖維化中的作用。無菌條件下開胸剪取SD大鼠心室，用胰蛋白酶消化法和差速貼壁法獲得心臟成纖維細胞。試驗采用3-4代心臟成纖維細胞，隨機分為以下5組:
　　

11、(1)空白對照組:細胞僅加入培養(yǎng)基Opti-MEM(@)工。
　　(2)Ald+control siRNA組:細胞加入Opti-MEM(@)I培養(yǎng)基，以及LipofectamineTM RNAiMAX轉(zhuǎn)染試劑和control siRNA的混合溶液，并加入Ald誘導(dǎo)細胞纖維化。
　　(3)Ald+ET-1 siRNA1組:細胞加入Opti-MEM(@)I培養(yǎng)基，以及LipofectamineTM RNAiMAX轉(zhuǎn)染試劑和ET-

12、1 siRNA1的混合溶液，并加入Ald誘導(dǎo)細胞纖維化。
　　(4)Ald+ET-1 siRNA2組:細胞加入Opti-MEM(@)工培養(yǎng)基，以及LipofectamineTM RNAiMAX轉(zhuǎn)染試劑和ET-1 siRNA2的混合溶液，并加入Ald誘導(dǎo)細胞纖維化。
　　(5)Ald+ET-1 siRNA3組:細胞加入Opti-MEM(@)I培養(yǎng)基，以及LipofectamineTM RNMMAX轉(zhuǎn)染試劑和ET-1 siRNA

13、3的混合溶液，并加入Ald誘導(dǎo)細胞纖維化。
　　采用ELISA法檢測心臟成纖維細胞和培養(yǎng)上清液中ET-1的變化（每組n=6），MTT法檢測心臟成纖維細胞的增殖（每組n=8），羥脯氨酸含量測定法檢測細胞培養(yǎng)上清液中膠原的含量（每組n=6）。
　　結(jié)果:
　　1.1同一時間點不同濃度siRNA的轉(zhuǎn)染結(jié)果空白對照組和LipofectamineTM RNAiMAX轉(zhuǎn)染試劑組，在各時間點的明場兩組間心臟成纖維細胞的數(shù)量無明顯差異

14、，表明本實驗中使用的LipofectamineTM RNAiMAX轉(zhuǎn)染試劑的濃度對細胞毒性較低;在熒光觀察時均未看到帶綠色熒光的細胞，說明siRNA轉(zhuǎn)染具有特異性。不同濃度siRNA轉(zhuǎn)染組在6h和12h均可在多數(shù)心臟成纖維細胞的胞質(zhì)和胞核觀察到明顯的綠色熒光，在24 h熒光強度明顯增強，并持續(xù)到48h，72h時熒光強度有所降低，但仍然較強。在6h和12h時，心臟成纖維細胞的轉(zhuǎn)染效率和綠色熒光蛋白的積分光密度值隨著siRNA轉(zhuǎn)染濃度的增加

15、呈濃度依賴性增加。在24h和48h時，各siRNA轉(zhuǎn)染濃度組的轉(zhuǎn)染效率和綠色熒光蛋白的積分光密度值均較高，100nmol/L組與其它各組有統(tǒng)計學(xué)差異(P＜0.05)。在72h時間點，低濃度組間轉(zhuǎn)染效率和綠色熒光蛋白的積分光密度值變化明顯(P＜0.05)，而高濃度組間變化不明顯。
　　1.2同一濃度不同時間點siRNA的轉(zhuǎn)染結(jié)果
　　在siRNA濃度12.5nmol/L時，轉(zhuǎn)染6h組細胞的轉(zhuǎn)染效率較低。與6h組相比，12h、2

16、4h、48h和72h組的轉(zhuǎn)染效率均顯著增加(P＜0.05，P＜0.05，P＜0.05，P＜0.05)。SiRNA濃度在12.5nmol/L時，轉(zhuǎn)染效率在24h組和48h組達高峰，72h組有所降低(P＜0.05)。SiRNA濃度在25nmol/L、50nmol/L和100nmol/L時，變化趨勢基本與12.5nmol/L相似，但72 h組轉(zhuǎn)染效率降低的均較12.5nmol/L少，并且siRNA濃度在50nmol/L時，72 h組與48 h

17、組相比無統(tǒng)計學(xué)差異。
　　2.1Ald和ET-1 siRNA對心臟成纖維細胞ET-1表達的影響
　　ELISA結(jié)果表明，與空白對照組相比，Ald+control siRNA組細胞中ET-1含量顯著升高(P＜0.01)。給予ET-1 siRNA后Ald+ET-1 siRNA1、Ald+ET-1 siRNA2和Ald+ET-1 siRNA3組細胞中ET-1含量，與Ald+control siRNA組相比均顯著降低(P＜0.01，

18、P＜0.01，P＜0.01)，并且明顯低于空白對照組（P＜0.01，P＜0.01，P＜0.01）。Ald+ET-1 siRNA2組比Ald+ET-1 siRNA1組和Ald+ET-1 siRNA3組細胞中ET-1含量降低更明顯，但無統(tǒng)計學(xué)差異。
　　2.2Ald和ET-1 siRNA對心臟成纖維細胞培養(yǎng)上清液中ET-1含量的影響
　　ELISA結(jié)果表明，與空白對照組相比，Ald+control siRNA組細胞培養(yǎng)上清中ET

19、-1的含量顯著升高(P＜0.01)。給予ET-1 siRNA后Ald+ET-1siRNA1、2和3組細胞培養(yǎng)上清中ET-1含量，與Ald+control siRNA組相比均顯著降低(P＜0.01，P＜0.01，P＜0.01)，并且明顯低于空白對照組(P＜0.01,P＜0.01,P＜0.01)。Ald+ET-1 siRNA2組比Ald+ET-1 siRNA1組和Ald+ET-1 siRNA3組上清中ET-1含量降低更明顯，但無統(tǒng)計學(xué)差異。

20、與Ald+control siRNA組相比，給予ET-1 siRNA后的Ald+ET-1 siRNA三組細胞培養(yǎng)上清中ET-1含量較細胞中ET-1含量的降低更明顯。
　　2.3Ald和ET-1 siRNA對心臟成纖維細胞增殖的影響
　　MTT結(jié)果表明，與空白對照組相比，Ald+control siRNA組的平均吸光度值明顯升高（P＜0.01）。與Ald+control siRNA組相比，給予ET-1 siRNA后Ald+ET

21、-1 siRNA1、Ald+ET-1 siRNA2和Ald+ET-1 siRNA3組的平均吸光度值均顯著降低(P＜0.01，P＜0.01，P＜0.01)。Ald+ET-1 siRNA1組的平均吸光度值仍高于空白對照組(P＜0.05)，而Ald+ET-1 siRNA2和Ald+ET-1siRNA3組的平均吸光度值與空白對照組無統(tǒng)計學(xué)差異。
　　2.4Ald和ET-1 siRNA對心臟成纖維細胞培養(yǎng)上清中膠原含量的影響
　　羥脯

22、氨酸含量測定表明，與空白對照組相比，Ald+control siRNA組細胞培養(yǎng)上清中膠原含量顯著升高(P＜0.01)。給予ET-1 siRNA后Ald+ET-1siRNA1、Ald+ET-1 siRNA2和Ald+ET-1 siRNA3組細胞培養(yǎng)上清中膠原含量，與Ald+control siRNA組相比均顯著降低(P＜0.01，P＜0.01，P＜0.01)，但仍高于空白對照組(P＜0.01，P＜0.01，P＜0.01)。Ald+ET-