β-羥基異戊酰紫草素通過(guò)PI3K-AKT-mTOR信號(hào)通路靶向抑制宮頸癌的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、宮頸癌是最常見(jiàn)的婦科惡性腫瘤，其發(fā)病機(jī)制至今尚未完全闡明。臨床上，宮頸癌的治療方法主要有手術(shù)切除、放療、化療以及中醫(yī)中藥治療。最佳的治療方法則是結(jié)合各種療法的優(yōu)點(diǎn)，對(duì)宮頸癌實(shí)施多學(xué)科綜合治療。近年來(lái)研究表明，磷脂酰肌醇-3-激酶/蛋白激酶B/哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白(phosphatidylinositol3-kinase/protein kinase B/mammaliantarget of rapamycin，PI3K/AKT/mTO

2、R)信號(hào)通路具有調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)、促進(jìn)細(xì)胞周期進(jìn)展、參與新生血管形成以及使腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生放化療拮抗等多種功能，是最主要的抑制腫瘤細(xì)胞凋亡的信號(hào)通路。在惡性腫瘤的發(fā)生過(guò)程中存在PI3K/AKT/mTOR信號(hào)通路的激活，因此，阻斷該信號(hào)通路對(duì)惡性腫瘤的治療與預(yù)后均具有重要意義?；赑I3K/AKT/mTOR信號(hào)通路開(kāi)發(fā)相關(guān)靶點(diǎn)抑制劑，通過(guò)觸發(fā)腫瘤細(xì)胞凋亡以及聯(lián)合應(yīng)用化放療在宮頸癌多學(xué)科綜合治療中發(fā)揮重要作用，已成為宮頸癌分子靶向治療的重要熱點(diǎn)

3、。
　　中醫(yī)藥在宮頸癌多學(xué)科綜合治療中具有獨(dú)特作用。紫草素(shikonin)是一類(lèi)從紫草植物根中提取的萘醌類(lèi)化合物，化學(xué)成分復(fù)雜，具有抗腫瘤、抗炎、抗HIV病毒和抗真菌等廣泛的藥理作用。由于紫草素的毒性較強(qiáng)而其抗腫瘤作用不具特異性，因而未能在臨床上被推廣應(yīng)用。近年來(lái)，提取或合成高效低毒的紫草素衍生物的研究備受關(guān)注。β-羥基異戊酰紫草素(β-hydroxyisovalerylshikon，β-HIVS)即是天然存在的紫草素衍生物之

4、一。β-HIVS通過(guò)抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)增殖、誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡、干擾腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)周期，使其具有開(kāi)發(fā)為新型高效低毒抗腫瘤藥物的潛力。本課題通過(guò)體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)來(lái)研究β-HIVS抗宮頸癌的分子作用機(jī)制以及與PI3K/AKT/mTOR信號(hào)通路的相關(guān)性，為臨床宮頸癌的中藥分子靶向治療提供新的策略和有效途徑。
　　第一部分 PTEN、Survivin、PI3K/AKT/mTOR信號(hào)通路與宮頸癌變演化關(guān)系的臨床研究
　　目的:結(jié)合宮頸病變的臨床病

5、理學(xué)特征，探討PTEN、Survivin、PI3K、AKT、mTOR、P70S6K在宮頸癌變演化過(guò)程中的表達(dá)及其臨床意義。
　　方法:收集20例宮頸糜爛伴鱗狀上皮化生、60例宮頸上皮內(nèi)瘤變(CINⅠ、CINⅡ、CINⅢ各20例)以及56例宮頸鱗狀上皮細(xì)胞癌組織標(biāo)本。應(yīng)用免疫組織化學(xué)（SP法）、實(shí)時(shí)定量PCR(qRT-PCR)和蛋白質(zhì)印跡法(Western Blot)檢測(cè)各組宮頸組織中PTEN、Survivin、PI3K、AKT、m

6、TOR、P70s6K的表達(dá)。選取10例正常宮頸組織作為對(duì)照組。
　　結(jié)果:1）在宮頸癌變演化過(guò)程中，從正常宮頸、宮頸糜爛伴鱗化、宮頸上皮內(nèi)瘤變到宮頸癌，PTEN陽(yáng)性表達(dá)率逐漸減弱(P＜0.05);而Survivin的表達(dá)率則逐漸增高(P＜0.05);PI3K、AKT、mTOR、P70s6K在正常宮頸、宮頸糜爛伴鱗化、宮頸上皮內(nèi)瘤變以及宮頸癌組織中的陽(yáng)性表達(dá)率均呈逐漸增加趨勢(shì)(P＜0.05)。2) PTEN在宮頸癌中的陽(yáng)性表達(dá)與臨床

7、分期、病灶大小有關(guān)(P＜0.05);Survivin在宮頸癌中的陽(yáng)性表達(dá)與臨床分期、病灶大小和腫瘤分化程度有關(guān)(P＜0.05);宮頸癌組織中PI3K、AKT和mTOR的陽(yáng)性表達(dá)率與臨床分期、分化程度有關(guān)（P＜0.05）;P70S6K在宮頸癌中的陽(yáng)性表達(dá)與臨床分期有關(guān)(P＜0.05)。3）PTEN與Survivin在宮頸癌組織中的表達(dá)呈顯著負(fù)相關(guān)（r2=-0.613，P＜0.01）;P70s6K在宮頸癌組織中的表達(dá)與PI3K、AKT、mT

8、OR呈明顯正相關(guān)(r10=0.418，P＜0.01;r11=0.512，P＜0.05; r12=0.365，P＜0.01);PI3K與AKT、mTOR呈明顯正相關(guān)(r13=0.438，P＜0.01;r14=0.366，P＜0.01);AKT與mTOR呈明顯正相關(guān)(r15=0.351，P＜0.01)。4）qRT-PCR檢測(cè)顯示，PTEN mRNA在宮頸癌、CINⅢ組織中的表達(dá)顯著低于正常宮頸組織(P＜0.01);Survivin mRNA

9、在宮頸癌、CINⅢ組織中明顯高于正常宮頸組織(P＜0.01);PI3K、AKT、mTOR和P70S6KmRNA在宮頸癌、CINⅢ組織中均明顯高于正常宮頸組織(P＜0.01)，在CINⅡ組織中的表達(dá)也均高于正常宮頸組織(P＜0.05)。5)Western Blot檢測(cè)顯示，PTEN蛋白在宮頸癌、CINⅢ、CINⅡ、CINⅠ組織中的表達(dá)顯著低于正常宮頸組織(P＜0.01);Survivin蛋白表達(dá)在宮頸癌、CINⅢ組織中明顯高于正常宮頸組織

10、(P＜0.01)，在CINⅡ中的表達(dá)亦高于正常宮頸組織(P＜0.05);PI3K在宮頸癌、CINⅢ、CINⅡ、CINⅠ組織中的表達(dá)均明顯高于正常宮頸組織(P＜0.01); AKT、mTOR和P70s6K蛋白表達(dá)在宮頸癌、CINⅢ組織中均明顯高于正常宮頸組織(P＜0.01)，在CINⅡ中的表達(dá)也均高于正常宮頸組織(P＜0.05)。
　　結(jié)論:PTEN、Survivin、PDK、AKT、mTOR和P70S6K在宮頸癌變演化過(guò)程中存在聯(lián)

11、合表達(dá)，協(xié)同參與了宮頸癌的發(fā)生及其進(jìn)展。聯(lián)合檢測(cè)為宮頸癌的早期診斷和預(yù)后判斷提供了新的評(píng)價(jià)指標(biāo)，也為宮頸癌的基因治療提供了新的生物學(xué)靶點(diǎn)。
　　第二部分 β-羥基異戊酰紫草素通過(guò)PI3K/AKT/mTOR信號(hào)通路誘導(dǎo)人宮頸癌Hala細(xì)胞凋亡的體外實(shí)驗(yàn)研究
　　目的:研究β-羥基異戊酰紫草素(β-HIVS)對(duì)人宮頸癌Hela細(xì)胞的體外生長(zhǎng)抑制作用，探討β-HIVS促腫瘤細(xì)胞凋亡的分子作用機(jī)制。
　　方法:以不同濃度β-H

12、IVS作用人宮頸癌Hela細(xì)胞，MTT法檢測(cè)β-HIVS對(duì)Hela細(xì)胞體外增殖的抑制率;AO/EB染色法熒光顯微鏡觀(guān)察Hela細(xì)胞凋亡的形態(tài)學(xué)變化;Annexin/PI雙標(biāo)記法檢測(cè)Hela細(xì)胞凋亡率;流式細(xì)胞儀分析Hela細(xì)胞周期分布;qRT-PCR和Westernblot法檢測(cè)Hela細(xì)胞中PI3K、AKT、mTOR、P70s6K的mRNA和蛋白表達(dá)水平變化。
　　結(jié)果:1）β-HIVS對(duì)Hela細(xì)胞體外增殖有顯著的抑制作用，呈

13、現(xiàn)明顯的量效關(guān)系和時(shí)間依賴(lài)性。2）隨著β-HIVS濃度增加，Hela細(xì)胞凋亡的數(shù)量和形態(tài)結(jié)構(gòu)均發(fā)生重要改變，細(xì)胞凋亡率也逐漸增加。細(xì)胞周期分析顯示，β-HIVS引起Hela細(xì)胞周期分布發(fā)生變化，表現(xiàn)為G0/G1細(xì)胞數(shù)下降，S期細(xì)胞數(shù)增多，而G2/M期細(xì)胞數(shù)則無(wú)明顯變化，細(xì)胞阻滯于S期。3）三種不同濃度β-HIVS作用Hela細(xì)胞，對(duì)PI3K、AKT、mTOR、P70S6K表達(dá)水平的影響呈時(shí)間和劑量依賴(lài)性;藥物作用48h后，β-HIVS能

14、顯著下調(diào)Hela細(xì)胞中PDK、AKT、mTOR和P70s6K的mRNA表達(dá)水平，并下調(diào)PI3K、AKT、p-AKT、mTOR、P70s6K的蛋白表達(dá)水平。
　　結(jié)論:β-HIVS能顯著抑制Hela細(xì)胞增殖，呈現(xiàn)明顯的時(shí)間和劑量依賴(lài)性。β-HIVS誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞發(fā)生凋亡可能是通過(guò)抑制PI3K/AKT/mTOR信號(hào)通路以及降低該通路中相關(guān)下游基因蛋白表達(dá)水平而發(fā)揮其抗癌作用。針對(duì)該信號(hào)通路的中藥分子靶向治療有望成為宮頸癌治療的新途徑。<

15、br>　　第三部分 β-羥基異戊酰紫草素通過(guò)PI3K/AKT/mTOR信號(hào)通路抑制宮頸癌裸鼠移植瘤生長(zhǎng)的實(shí)驗(yàn)研究
　　目的:建立宮頸癌荷瘤裸鼠動(dòng)物模型，觀(guān)察β-HIVS的體內(nèi)抑瘤效果，探討其抗腫瘤作用的分子機(jī)制。
　　方法:制備宮頸癌荷瘤裸鼠動(dòng)物模型。獲取瘤體組織后進(jìn)行大體標(biāo)本觀(guān)測(cè)，評(píng)價(jià)β-HIVS對(duì)裸鼠皮下移植腫瘤的抑制效果;HE染色法觀(guān)察細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化;Tunel染色法檢測(cè)腫瘤組織內(nèi)細(xì)胞凋亡狀態(tài);qRT-PCR、West

16、ern blot法檢測(cè)β-HIVS處理后PI3K、AKT、mTOR、P70S6K的mRNA和蛋白表達(dá)的變化。
　　結(jié)果:1）β-HIVS治療組宮頸癌移植瘤生長(zhǎng)速度明顯低于對(duì)照組，注射藥物后瘤體重量及體積縮小較對(duì)照組相比具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(p＜0.05)，β-HIVS治療組的抑瘤率達(dá)到32.80％。2)組織學(xué)HE染色顯示，β-HIVS治療組腫瘤細(xì)胞發(fā)生變性壞死，癌巢結(jié)構(gòu)疏松，核濃縮、碎裂，濃縮的染色質(zhì)圍繞于核周邊或形成新月體結(jié)構(gòu)。3）T

17、unel細(xì)胞凋亡原位檢測(cè)顯示，β-HIVS能誘導(dǎo)宮頸癌組織的腫瘤細(xì)胞發(fā)生凋亡。4）qRT-PCR檢測(cè)，經(jīng)β-HIVS治療后，移植瘤組織中PI3K、AKT、mTOR、P70s6K的mRNA表達(dá)均低于對(duì)照組(p＜0.01)。Western blot檢測(cè)，經(jīng)β-HIVS治療后，PI3K、AKT、p-AKT、mTOR和P70s6K的蛋白表達(dá)水平均明顯下降(p＜0.01)。
　　結(jié)論:β-HIVS通過(guò)誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡、抑制細(xì)胞增殖對(duì)宮頸癌移植瘤