CD90陽(yáng)性細(xì)胞篩選及PI3K-AKT信號(hào)通路對(duì)其干細(xì)胞樣特性影響的初步研究.pdf

1、目的：
　　肝癌是全球發(fā)病率最高的惡性腫瘤之一，廣西地區(qū)發(fā)病率更是高居中國(guó)的首位。近年來(lái)，基于腫瘤干細(xì)胞理論提出腫瘤治療新型理念并廣泛的在多種實(shí)質(zhì)細(xì)胞和動(dòng)物的體內(nèi)展開實(shí)驗(yàn)研究。越來(lái)越多的證據(jù)支持腫瘤異質(zhì)性的存在，而腫瘤干細(xì)胞為其根源。腫瘤干細(xì)胞來(lái)源于腫瘤細(xì)胞內(nèi)一群數(shù)量極少量生長(zhǎng)極度旺盛，有著強(qiáng)大的自我更新、無(wú)限增殖化分化、潛能、高度致成瘤性的細(xì)胞。此類細(xì)胞在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展過程以及腫瘤治療后的復(fù)發(fā)、對(duì)放化療的耐藥等方面，都起到了極

2、為重要的作用。而在腫瘤細(xì)胞中其他的多數(shù)細(xì)胞不具備無(wú)限增殖潛能，幾乎遵循的是短暫的分化成熟以后，最終發(fā)展為死亡的過程。我們認(rèn)為肝癌細(xì)胞中也存在著這樣一群肝癌干細(xì)胞，通過無(wú)血清懸浮成球培養(yǎng)，流式細(xì)胞技術(shù)能夠篩選出肝癌干細(xì)胞，并進(jìn)一步探討PI3K/AKT信號(hào)通路對(duì)肝癌細(xì)胞系MHCC97L中CD90（Thy-1）陽(yáng)性亞群細(xì)胞比例及干細(xì)胞特性的影響。
　　方法:
　　1.采用完全培養(yǎng)基和無(wú)血清培養(yǎng)基加入相關(guān)生長(zhǎng)因子培養(yǎng)肝癌細(xì)胞系MHC

3、C97L，分別進(jìn)行貼壁和懸浮成球培養(yǎng)，收集相應(yīng)細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。
　　2.糖原染色方法檢測(cè)細(xì)胞球來(lái)源。
　　3.流式細(xì)胞技術(shù)（flow cytometry）檢測(cè)MHCC97L細(xì)胞系中貼壁細(xì)胞和懸浮成球細(xì)胞流式抗體CD90的表達(dá)量。
　　4.貼壁培養(yǎng)和懸浮成球培養(yǎng)細(xì)胞分別經(jīng)PI3K/AKT信號(hào)通路抑制劑LY294002處理后，流式細(xì)胞技術(shù)檢測(cè)CD90表達(dá)量的變化。
　　5. MTT法檢測(cè)LY294002分別處理CD

4、90+亞群細(xì)胞和CD90-亞群細(xì)胞前后，兩組細(xì)胞的增殖率變化。
　　6. qRT-PCR檢測(cè)LY294002分別處理CD90+亞群細(xì)胞和CD90-亞群細(xì)胞前后，其肝癌干細(xì)胞相關(guān)基因CD90，SHP2的表達(dá)量的變化
　　7. Western blot檢測(cè)CD90+亞群細(xì)胞和CD90-亞群細(xì)胞經(jīng)LY294002處理前后肝癌干細(xì)胞相關(guān)蛋白以及PI3K/AKT信號(hào)通路相關(guān)蛋白的表達(dá)情況。
　　8.平板克隆實(shí)驗(yàn)檢測(cè)LY29400

5、2對(duì)CD90+亞群細(xì)胞和CD90-亞群細(xì)胞克隆形成能力的影響。
　　9.比較不同濃度梯度的CD90+亞群細(xì)胞和CD90-亞群細(xì)胞裸鼠皮下成瘤能力，以及LY294002處理后成瘤能力的變化情況。
　　10.免疫組織化學(xué)法檢測(cè)CD90+亞群細(xì)胞和CD90-亞群細(xì)胞所形成的裸鼠皮下瘤中肝癌干細(xì)胞相關(guān)蛋白和PI3K/AKT信號(hào)通路相關(guān)蛋白表達(dá)量；以及經(jīng)LY294002處理后相應(yīng)蛋白表達(dá)量變化情況。
　　結(jié)果：
　　1.肝

6、癌細(xì)胞系MHCC97L細(xì)胞在完全培養(yǎng)基中貼壁培養(yǎng)約5天可以穩(wěn)定傳代；在無(wú)血清培養(yǎng)基懸浮成球培養(yǎng)約7-9天可以穩(wěn)定傳代。
　　2.糖原染色可說明細(xì)胞球來(lái)源于肝癌細(xì)胞。
　　3.流式細(xì)胞儀檢測(cè)結(jié)果表明肝癌干細(xì)胞標(biāo)志物CD90在成球培養(yǎng)細(xì)胞中的表達(dá)量高于在貼壁培養(yǎng)細(xì)胞中的表達(dá)量（P<0.01）。
　　4.經(jīng)PI3K/AKT信號(hào)通路抑制劑LY294002處理后，流式細(xì)胞技術(shù)檢測(cè)CD90+亞群細(xì)胞CD90表達(dá)量下降較CD90-亞

7、群細(xì)胞明顯（P<0.05）。
　　5. CD90+亞群和CD90-亞群的細(xì)胞中，MTT法檢測(cè)CD90+亞群細(xì)胞增值率變化較CD90-亞群細(xì)胞明顯。
　　6.加入LY294002抑制劑后，qRT-PCR檢測(cè)CD90+亞群細(xì)胞中肝癌干細(xì)胞相關(guān)基因CD90、SHP2的表達(dá)量較未加入LY294002前表達(dá)量明顯下降（P<0.05）；CD90-亞群細(xì)胞表達(dá)量變化不明顯。
　　7.加入LY294002抑制劑后，Western bl

8、ot檢測(cè)CD90+亞群細(xì)胞中的肝癌干細(xì)胞相關(guān)蛋白CD90、SHP2的表達(dá)量下降明顯（P<0.05）。PI3K/AKT信號(hào)通路的下游特異性蛋白P-AKT的表達(dá)量下降（P<0.05）；AKT蛋白表達(dá)量無(wú)明顯變化。
　　8. CD90+亞群細(xì)胞和CD90-亞群細(xì)胞克隆形成率分別為（93.13±4.72）％、（20.59±3.23）%，CD90+亞群細(xì)胞克隆形成率明顯高于CD90-亞群細(xì)胞。CD90+亞群細(xì)胞和CD90-亞群細(xì)胞加入LY2

9、94002后，克隆形成率分別為（51.32±6.27）%、（18.37±3.21），CD90+亞群細(xì)胞克隆形成率顯著降低（P<0.05），而加入LY294002對(duì)CD90-亞群細(xì)胞克隆形成率無(wú)明顯影響（P>0.05）。
　　9.相同細(xì)胞個(gè)數(shù)下，CD90+亞群細(xì)胞裸鼠皮下成瘤能力明顯高于CD90-亞群細(xì)胞成瘤能力。
　　10. CD90蛋白和SHP2蛋白在CD90+亞群細(xì)胞未加藥時(shí)表達(dá)明顯強(qiáng)于CD90+亞群細(xì)胞加抑制劑LY29

10、4002后的表達(dá)量；CD90-亞群細(xì)胞未加藥的表達(dá)量與加藥后變化不大。經(jīng)LY294002處理后，CD90+亞群細(xì)胞所形成的裸鼠移植瘤中CD90、SHP2、P-AKT蛋白表達(dá)量均較對(duì)照組明顯減少，AKT蛋白表達(dá)量無(wú)明顯變化；CD90-亞群細(xì)胞所形成的裸鼠移植瘤中CD90、SHP2、P-AKT、AKT蛋白表達(dá)量無(wú)明顯變化。
　　結(jié)論:
　　無(wú)血清的條件培養(yǎng)基能較好的富集有肝癌干細(xì)胞特性的細(xì)胞亞群，流式分選MHCC97L細(xì)胞系所獲