褐飛虱氣味結(jié)合蛋白基因克隆與分析.pdf

1、昆蟲嗅覺在其各項行為活動中如尋找寄主、配偶或適合的產(chǎn)卵場所等具有極其重要的作用。如果明確昆蟲的嗅覺機制，將可為害蟲防治與監(jiān)控提供新思路。目前研究表明，氣味結(jié)合蛋白(odorant-bindingproteins，OBPs)在嗅覺感受的氣味分子運輸中起著重要作用，但對于其確切的生理功能尚未明確。褐飛虱Nilaparvatalugens(St(a)l)是一種水稻和野生稻的專食性害蟲，具遷飛性，其成蟲及若蟲多聚集于陰暗潮濕的水稻基部取食。隨著

2、褐飛虱抗藥性的增強，普通的化學(xué)防治已經(jīng)難以控制褐飛虱的為害。如果能明確褐飛虱的嗅覺感受機制，將可為利用行為調(diào)控褐飛虱提供理論依據(jù)。為此，本課題以褐飛虱為研究對象，通過克隆OBPs基因，測定了OBPs基因的時空表達譜，分析了重組OBPs蛋白與水稻揮發(fā)物的結(jié)合特性，以期為明確OBPs在褐飛虱嗅覺反應(yīng)中的生理功能奠定理論基礎(chǔ)。本文的主要研究結(jié)果如下:
　　1、褐飛虱氣味結(jié)合蛋白基因(NlugOBPs)的克隆及序列分析
　　基于實驗

3、室已建轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，克隆了褐飛虱NlugOBP4、NlugOBP5、NlugOBP6、NlugOBP7等4個基因，分析結(jié)果表明，這些NlugOBPs都具有完整的開放閱讀框，大小分別為514bp、495bp、591bp、426bp，編碼167、164、196、141個氨基酸(GenBank后登錄號分別為KC663683、KC663684、KC663685、KC663686);通過對4條OBPs基因的氨基酸序列比對分析，表明它們都具有6個保守

4、的半胱氨酸位點，并無保守位點缺失及增加的現(xiàn)象，表明它們都屬于ClassicOBPs;經(jīng)過N-末端信號肽預(yù)測顯示，NlugOBP6和NlugOBP7分別包含19和20個氨基酸組成的信號肽序列，而NlugOBP4和NlugOBP5無信號肽。
　　2、褐飛虱NlugOBPs基因的時空表達譜研究
　　通過熒光定量檢測褐飛虱NlugOBP6、NlugOBP7、NlugOBP8、NlugOBP9等4個基因的時空表達譜。結(jié)果表明，4個Nl

5、ugOBPs基因均主要表達于褐飛虱觸角，且在觸角中的表達量受到褐飛虱日齡的影響;在同一發(fā)育時期，NlugOBPs基因在雌蟲中的表達量顯著高于雄蟲中的表達量;除了個別日齡外，NlugOBPs基因在不同翅型間的表達量并未存在明顯差異;NlugOBPs基因在短翅雌蟲中的相對表達量明顯受交配與否的影響，3日齡未交配褐飛虱NlugOBPs基因的表達量明顯大于已交配的褐飛虱(P＜0.05）;5日齡已交配長翅褐飛虱NlugOBP6基因的表達量顯著高于

6、未交配褐飛虱;而在5日齡未交配短翅褐飛虱中的表達量高于已交配褐飛虱(P＜0.01）。
　　3、褐飛虱NlugOBPs的原核表達、純化及結(jié)合特性分析
　　成功構(gòu)建了NlugOBP4與原核表達載體pET-22b的重組質(zhì)粒，并將重組質(zhì)粒導(dǎo)入表達宿主細胞BL21(DE3)中成功表達;通過包涵體變復(fù)性獲得含大量目的蛋白的雜蛋白液，再經(jīng)DE52和QFF陰離子交換層析柱純化，獲得純化的重組蛋白NlugOBP4。
　　以1-NPN為熒