二化螟氣味結(jié)合蛋白的基因克隆、組織分布及配體結(jié)合能力分析.pdf

1、在長(zhǎng)期的進(jìn)化過程中，昆蟲形成了高度靈敏的嗅覺系統(tǒng)，并以此來感受外界環(huán)境中的氣味物質(zhì)，從而做出相應(yīng)的行為或生理反應(yīng)，如尋找配偶、食物和棲息場(chǎng)所等。昆蟲的嗅覺分為外周和中樞神經(jīng)感受兩個(gè)過程，在外周神經(jīng)感受過程中，嗅覺感器腔內(nèi)大量存在氣味結(jié)合蛋白(Odorantbindingproteins，OBPs)負(fù)責(zé)將進(jìn)入到感器腔內(nèi)的脂溶性氣味物質(zhì)結(jié)合并運(yùn)輸?shù)轿挥诟惺苌窠?jīng)膜上的氣味受體(Odorantreceptor,OR)，因此OBP和氣味物質(zhì)的作用

2、是昆蟲嗅覺的第一個(gè)生化步驟。二化螟Chilosuppressalis(Walker)是一種重要的農(nóng)業(yè)害蟲，對(duì)其OBP的研究，不僅有助于深入理解昆蟲的嗅覺機(jī)制，而且可以為開發(fā)高效行為調(diào)控技術(shù)提供新的靶標(biāo)基因，提高二化螟的可持續(xù)防治水平。然而，國(guó)內(nèi)外有關(guān)二化螟OBP的研究較少，本研究利用所在研究組測(cè)得的二化螟基因組數(shù)據(jù)，通過生物信息學(xué)和分子生物學(xué)相結(jié)合的方法，得到26個(gè)OBP基因的cDNA片段，并進(jìn)一步克隆得到其中6個(gè)OBP基因的全長(zhǎng)cDN

3、A序列。在此基礎(chǔ)上，測(cè)定5個(gè)OBP基因的組織表達(dá)譜，并利用蛋白體外表達(dá)技術(shù)及熒光競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合實(shí)驗(yàn)初步探討了其中一個(gè)OBP的生理功能。主要結(jié)果如下:
　　1.二化螟OBP基因的克隆及序列分析
　　結(jié)合基因組數(shù)據(jù)分析并利用PCR技術(shù)，獲得了29個(gè)OBP基因cDNA片段并對(duì)其中的26個(gè)進(jìn)行了成功驗(yàn)證，進(jìn)一步克隆了其中6個(gè)OBP的全長(zhǎng)cDNA序列，分別命名為CsupOBP1、CsupOBP2、CsupOBP3、CsupOBP4、Csup

4、OBP5和CsupABPX。序列分析表明，CsupOBP3、CsupOBP4和CsupABPX具有6個(gè)保守的半胱氨酸位點(diǎn)，屬典型的OBP基因;但CsupOBP1、CsupOBP2和CsupOBP5只有4個(gè)保守的半胱氨酸位點(diǎn)，為Minus-COBP基因。CsupOBP2、CsupOBP3、CsupOBP4和CsupABPX的氨基酸序列與其它鱗翅目昆蟲OBP具有很高的相似性，分別為81％、66％、61％、70％;CsupOBP1和CsupO

5、BP5的氨基酸序列與其它鱗翅目昆蟲OBP的相似性較低，分別為34％、43％。
　　2.二化螟OBP基因在不同組織的表達(dá)量分析
　　為了探討CsupOBP基因的功能，利用RT-qPCR技術(shù)檢測(cè)并比較了CsupOBP1、CsupOBP2、CsupOBP4、CsupOBP5和CsupABPX等5個(gè)基因在幼蟲及雌雄成蟲不同組織中的表達(dá)量。結(jié)果表明，在幼蟲期4個(gè)OBP主要在頭部表達(dá)，以CsupOBP1基因的表達(dá)量最高，其次是CsupO

6、BP2，而CsupOBP5和CsupABPX基因的表達(dá)量很低。在成蟲期，CsupABPX主要在觸角表達(dá)，在其他組織幾乎不表達(dá);CsupOBP2主要在頭部表達(dá)，在其他組織少量或不表達(dá);CsupOBP1在不同組織中都有表達(dá)，但以足、翅及雄性觸角和頭部的表達(dá)量較高;CsupOBP4和CsupOBP5主要在腹部高表達(dá)。這些CsupOBP基因在幼蟲頭部、成蟲觸角等化感組織中的高表達(dá)，暗示它們?cè)诙男嵊X或味覺中起重要作用。
　　3.二化螟

7、CsupOBP1的原核表達(dá)及配體結(jié)合能力分析
　　鑒于CsupOBP1基因在幼蟲期頭部、成蟲期雄性觸角及雌雄足、翅中均有較高表達(dá)，推測(cè)其在二化螟的嗅覺及味覺中起重要作用，為此進(jìn)一步進(jìn)行了體外功能研究。首先將該基因構(gòu)建到pET-30a(+)表達(dá)載體中，在大腸桿菌Escherichiacoli中經(jīng)IPTG誘導(dǎo)進(jìn)行大量表達(dá)，表達(dá)產(chǎn)物經(jīng)鎳離子親和層析、腸激酶酶解等步驟，得到純化的CsupOBP1蛋白。然后以1-NPN為探針，利用熒光競(jìng)爭(zhēng)結(jié)

8、合實(shí)驗(yàn)，測(cè)定了CsupOBP1對(duì)38種不同氣味物質(zhì)的結(jié)合能力。結(jié)果表明，在被測(cè)氣味物質(zhì)中，CsupOBP1只與β-紫羅蘭酮具有較強(qiáng)的結(jié)合能力，Ki值為9.53μM。p-紫羅蘭酮是包括二化螟寄主在內(nèi)的很多植物中普遍存在的一種芳香氣味組分，因此，CsupOBP1可能通過對(duì)該氣味物質(zhì)的識(shí)別從而在二化螟對(duì)寄主植物的定向中起作用。
　　4.二化螟成蟲對(duì)β-紫羅蘭酮等植物揮發(fā)性化合物的EAG反應(yīng)
　　上述配體結(jié)合實(shí)驗(yàn)結(jié)果認(rèn)為，CsupO