稻縱卷葉螟氣味結(jié)合蛋白的功能分析.pdf

1、昆蟲的嗅覺在其生命活動(dòng)過程中起著重要作用，許多研究表明氣味結(jié)合蛋白(OBPs)參與了識(shí)別外界物質(zhì)的第一步，但對(duì)于OBPs在昆蟲中確切的生理功能并不是很清晰。稻縱卷葉螟Cnaphalocrocis medmalis是水稻上重要的害蟲，我們通過觸角轉(zhuǎn)錄組測(cè)序，鑒定了多個(gè)CmedOBPs基因，但對(duì)于CmedOBPs在其嗅覺感受中的功能并不是很清晰。為此，本課題擬以稻縱卷葉螟為研究對(duì)象，在克隆其CmedOBPs基因及CmedOBPs基因表達(dá)模式

2、分析的基礎(chǔ)上，通過體外結(jié)合實(shí)驗(yàn)并結(jié)合RNAi技術(shù)，對(duì)CmedOBPs的功能進(jìn)行探索，以期為明確稻縱卷葉螟寄主定位的分子機(jī)制提供依據(jù)。主要研究結(jié)果如下:
　　1.稻縱卷葉螟翅和足的掃描電鏡觀察
　　掃描電鏡的結(jié)果顯示，稻縱卷葉螟雌雄成蟲翅上主要有非嗅覺感器鱗形和刺形兩種感器。稻縱卷葉螟的足上除了嗅覺感器錐形和毛形感器外還有鱗形感器、刺形感器和B(o)hm鬃毛3種非嗅覺感器，數(shù)量統(tǒng)計(jì)顯示前足感器多于后足，后足多于中足。雌雄翅及足

3、上的感器無(wú)性二型現(xiàn)象。
　　2.稻縱卷葉螟CmedOBPs基因克隆及序列分析
　　本實(shí)驗(yàn)成功克隆出CmedOBP5、CmedOBP8、CmedOBP10、CmedOBP13、CmedOBP14、CmedOBP20共6個(gè)基因。序列分析發(fā)現(xiàn)CmedOBP5、CmedOBP8和CmedOBP14都有6個(gè)保守的半胱氨酸Cys，符合Classic OBPs的特征;而CmedOBP13有7個(gè)Cys，CmedOBP10有15個(gè)保守的Cys

4、，屬于Plus-C OBPs;CmedOBP20有5個(gè)Cys，屬于Minus-C OBPs。信號(hào)肽預(yù)測(cè)結(jié)果表明，CmedOBP5、CmedOBP8、CmedOBP10、CmedOBP13、CmedOBP14、CmedOBP20分別含有18、17、20、22、25和16個(gè)信號(hào)肽。
　　3.稻縱卷葉螟CmedOBPs基因的時(shí)空表達(dá)
　　對(duì)上述6個(gè)基因在雌雄蟲羽化后，交配未交配、各日齡段、各組織部位的表達(dá)量用熒光定量的方法進(jìn)行分析

5、。結(jié)果顯示CmedOBP13、CmedOBP14、CmedOBP20主要在3日齡成蟲觸角(At)高表達(dá)，雌雄間有差異，可能主要行使化學(xué)感受的作用;其它3個(gè)基因在主要組織部位的表達(dá)量因成蟲齡期、性別和交配狀態(tài)的不同而有一定差異，CmedOBP5主要在1日齡雌雄成蟲翅中(W)高表達(dá);CmedOBP8主要高表達(dá)于雌雄成蟲脂肪體(Fa);CmedOBP10主要在未交配的5日齡雌雄蟲頭部(H)高表達(dá)，可能行使其它生理功能。
　　4.Cmed

6、OBP5和CmedOBP14的表達(dá)、純化及結(jié)合特性分析
　　以實(shí)驗(yàn)室已有載體構(gòu)建了重組質(zhì)粒pET-22b(+)-CmedOBP14、pET-22b(+)-CmedOBP5、pET-30a(+)-CmedOBP16、pET-30a(+)-CmedOBP20、pET-28a(+)-CmedOBP10和pET-28a(+)-CmedOBP13。使其在表達(dá)菌株表達(dá)后，獲得了純蛋白CmedOBP5和CmedOB P14。熒光競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合實(shí)驗(yàn)結(jié)果

7、顯示，CmedOBP14與37種水稻揮發(fā)物的結(jié)合力除烷烴類和己醛外在中性條件下比在酸性條件下要強(qiáng)一些。除反-2-己醛，(-)-檸檬烯、3-蒈烯、橙花叔醇外，CmedOBP5在pH=7.4條件下與揮發(fā)物的結(jié)合力高于pH5.0。這可能與pH的不同引起OBPs不同的構(gòu)象變化有關(guān)。
　　選取與CmedOBP5結(jié)合能力較強(qiáng)的5種物質(zhì)（側(cè)柏烯、柏木腦、十六烷、順-3-己烯醇、石竹烯）在16℃和27℃下進(jìn)行熒光猝滅實(shí)驗(yàn)。結(jié)果顯示柏木腦和順-3-

8、己烯醇與CmedOBP5呈穩(wěn)定靜態(tài)結(jié)合，計(jì)算其結(jié)合常數(shù)和結(jié)合位點(diǎn)，得出其作用力均為疏水作用力。
　　5.行為活性物質(zhì)的篩選
　　查找文獻(xiàn)發(fā)現(xiàn)在熒光競(jìng)爭(zhēng)實(shí)驗(yàn)中與CmedOBP14結(jié)合能力較強(qiáng)的揮發(fā)物中有13種揮發(fā)物能導(dǎo)致稻縱卷葉螟產(chǎn)生強(qiáng)烈的電生理信號(hào)。為進(jìn)一步了解CmedOBP14在稻縱卷葉螟嗅覺感受中的功能，利用觸角電位(EAG)技術(shù)測(cè)定了注射dsCmedOBP14后，稻縱卷葉螟對(duì)揮發(fā)物的EAG反應(yīng)。結(jié)果表明，注射dsRNA

9、后稻縱卷葉螟成蟲對(duì)橙花叔醇(Nerolidol)、檸檬烯((-)-Limonene）、β-紫羅蘭酮(β-ionone)、十六烷(Hexadecane)、二十一烷(Henicosane)的EAG反應(yīng)顯著降低。
　　利用H-型嗅覺儀，測(cè)定了稻縱卷葉螟對(duì)上述5種揮發(fā)物行為反應(yīng)。結(jié)果表明，橙花叔醇、檸檬烯、十六烷和二十一烷等幾種物質(zhì)對(duì)稻縱卷葉螟具有顯著的引誘作用，β-紫羅蘭酮?jiǎng)t具有趨避作用。注射dsCmedOBP14后，稻縱卷葉螟對(duì)橙花叔