柳蠶鈣整合素結(jié)合蛋白基因的克隆與功能分析.pdf

1、柳蠶Actias selene Hübner是重要的野生絹絲昆蟲之一。柳蠶相對于家蠶，體型大，蛋白含量高，蠶絲耐腐蝕。目前對柳蠶的開發(fā)利用報(bào)道還很少，有待深入研究。同時，CIB蛋白在脊椎動物特別是哺乳動物中研究的較多，目前在無脊椎動物中報(bào)道的還很少。
　　本實(shí)驗(yàn)中，經(jīng) PCR擴(kuò)增，克隆，測序，獲得柳蠶鈣整合素結(jié)合蛋白基因（Calcium and intrgrin binding protein of Actias selene H

2、übner, AsCIB）的開放閱讀框（Open Reading Frame, ORF）序列,該序列全長558 bp。該序列編碼185個氨基酸，預(yù)測蛋白分子量約21.26 kDa，氨基酸序列中沒有信號肽。系統(tǒng)進(jìn)化樹分析以及氨基酸序列比對結(jié)果表明柳蠶 CIB基因與家蠶和大紅斑蝶等鱗翅目昆蟲的同源性最高，高達(dá)95％左右。后克隆目的片段與pET-28a表達(dá)載體相連接，構(gòu)建出重組表達(dá)質(zhì)粒pET-28a-AsCIB，并將其轉(zhuǎn)化入感受態(tài)細(xì)胞BL21

3、（DE3）中，用不同濃度的 IPTG進(jìn)行小量誘導(dǎo)表達(dá)。經(jīng) SDS-PAGE電泳和蛋白免疫印跡Western-blot分析表明，重組蛋白成功誘導(dǎo)表達(dá)，分子量大小為24 kDa。經(jīng)大量誘導(dǎo)后用Ni-NTA親和層析柱對重組蛋白進(jìn)行純化，蛋白定量免疫新西蘭大白兔制備多克隆抗體。
　　以柳蠶5齡期的頭、脂肪體、中腸、絲腺、馬氏管、血細(xì)胞、卵巢等組織為實(shí)驗(yàn)材料，提取其總RNA，通過熒光定量分析柳蠶CIB基因在不同組織中的表達(dá)情況。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明

4、柳蠶 CIB在脂肪體中表達(dá)量最高，其他組織中也均有不同程度表達(dá)。
　　取柳蠶的蛹，分兩組，一組注射柳蠶 CIB基因的 siRNA（small interfering RNA），一組作為對照。分別取24h，48h蛹組織，提取RNA，通過熒光定量檢測發(fā)現(xiàn)siRNA干擾CIB基因下調(diào)后明顯影響相關(guān)的基因在蛹期組織中的表達(dá)，其中三個效應(yīng)基因整合素α1亞基（integrinα1）、polo樣蛋白激酶(polo-like-kinase1, P