蘇云金芽胞桿菌對(duì)灰飛虱高效殺蟲(chóng)新基因的挖掘與功能研究.pdf

1、蘇云金茅胞桿菌(Bacillus thuringiensis，簡(jiǎn)稱(chēng)Bt)，是一種革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌，具有高度特異的殺蟲(chóng)活性。幾十年的應(yīng)用實(shí)踐表明，Bt制劑及轉(zhuǎn)Bt殺蟲(chóng)基因植物是最為有效的農(nóng)業(yè)害蟲(chóng)生物防治手段之一。稻飛虱一直以來(lái)都是危害水稻的重要害蟲(chóng)，經(jīng)常性爆發(fā)成災(zāi)，給水稻的安全生產(chǎn)構(gòu)成嚴(yán)重威脅，而且生產(chǎn)上對(duì)稻飛虱的防控主要依賴(lài)化學(xué)農(nóng)藥，致使稻飛虱的抗藥性增強(qiáng)而再猖獗危害，同時(shí)導(dǎo)致嚴(yán)重的環(huán)境污染和食品安全問(wèn)題。為此，如何實(shí)現(xiàn)稻飛虱的高效綠色防

2、控是一個(gè)亟待解決的熱點(diǎn)問(wèn)題和應(yīng)用型難題。但是，迄今對(duì)稻飛虱有高殺蟲(chóng)活性的Bt基因資源的發(fā)掘仍是空白，嚴(yán)重阻礙了Bt殺蟲(chóng)譜的拓展與大面積推廣應(yīng)用。
　　本論文從建立標(biāo)準(zhǔn)生測(cè)體系和廣泛篩選、鑒定批量Bt菌株對(duì)稻飛虱的殺蟲(chóng)活性入手，成功獲得一株對(duì)灰飛虱(Laodelphax striatellus，small brown planthopper，SBPH)有高效殺蟲(chóng)活性的Bt菌株，并進(jìn)行了新殺蟲(chóng)活性基因的挖掘與功能驗(yàn)證。
　　1.

3、篩選對(duì)灰飛虱有殺蟲(chóng)活性的Bt菌株
　　改良傳統(tǒng)的稻飛虱生測(cè)方法?；绎w虱對(duì)濕度反應(yīng)比較敏感，因北方空氣干燥，即使在恒溫恒溫光照培養(yǎng)箱中，濕度控制也不能滿(mǎn)足灰飛虱生測(cè)需要，對(duì)照組死亡率常達(dá)到20％以上。改進(jìn)后的生測(cè)系統(tǒng)采用透明塑料瓶，瓶底加入2％瓊脂糖凝膠，保證了良好的濕度環(huán)境。經(jīng)過(guò)改良后的生測(cè)體系，對(duì)照組死亡率可以控制在10％以下。而且，此裝置瓶身、瓶蓋可分離，更利于更換飼料，方便大批量操作，為殺蟲(chóng)基因的高通量篩選奠定了堅(jiān)實(shí)基礎(chǔ)。<

4、br>　　高殺蟲(chóng)活性菌株篩選。以改良后的生測(cè)體系為基礎(chǔ)，利用添加了Bt晶體蛋白的人工飼料飼喂灰飛虱，測(cè)定了來(lái)自中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所生物技術(shù)組保存的68株候選Bt菌株對(duì)灰飛虱的殺蟲(chóng)活性。成功獲得一株對(duì)灰飛虱有高毒力（校正死亡率大于90％）的Bt菌株(IPPBI0TSUC1012)。
　　2.挖掘、鑒定對(duì)灰飛虱有殺蟲(chóng)活性的Bt新基因
　　殺蟲(chóng)蛋白的純化與活性測(cè)定。從IPPBI0TSUC1012菌株提取的Bt蛋白樣品經(jīng)過(guò)凝

5、膠過(guò)濾層析分離，將不同時(shí)間出峰的蛋白樣品分別進(jìn)行殺蟲(chóng)活性的測(cè)定，同時(shí)利用SDS-PAGE檢測(cè)蛋白質(zhì)條帶。聯(lián)合樣品中蛋白濃度（通過(guò)凝膠條帶的灰度值進(jìn)行量化）及殺蟲(chóng)活性的大?。ㄔ囅x(chóng)校正死亡率）進(jìn)行相關(guān)分析，明確了2條與殺蟲(chóng)活性高度相關(guān)的蛋白條帶(r=0.83)，1條與殺蟲(chóng)活性中度相關(guān)的蛋白條帶(r=0.66)。
　　Bt基因組測(cè)序與新基因挖掘。利用454及illumina測(cè)序平臺(tái)對(duì)IPPBI0TSUC1012菌株基因組進(jìn)行測(cè)序，拼接后

6、得到大小5.51 M的基因組草圖，共39個(gè)Scaffold。基因組序列經(jīng)過(guò)GeneMark.hmm PROKARYOTIC的預(yù)測(cè)一共預(yù)測(cè)到6063個(gè)蛋白質(zhì)編碼基因。上述基因經(jīng)過(guò)Uniport數(shù)據(jù)庫(kù)的注釋以后，產(chǎn)生5846條注釋結(jié)果，絕大多數(shù)(96.4％)預(yù)測(cè)到的蛋白質(zhì)編碼基因有注釋信息。利用“Cry，Cyt及VIP”對(duì)注釋結(jié)果進(jìn)行檢索，只有“Cry”返回兩條檢索數(shù)據(jù)，分別為T(mén)ranslation5511312..5512181(dire

7、ct)，290 aminoacids; Translation5512497..5513384(direct)，296 amino acids，并且對(duì)應(yīng)同一條注釋信息，在Uniport數(shù)據(jù)庫(kù)中此序列的Primary accession number為D4QGQ7(Cry64Aa1)。將基因組中預(yù)測(cè)的蛋白質(zhì)編碼序列，構(gòu)建成為Mascot本地?cái)?shù)據(jù)庫(kù)，進(jìn)行質(zhì)譜結(jié)果的檢索，上述兩條與殺蟲(chóng)活性高度相關(guān)的蛋白條帶，分別匹配基因組里注釋信息為D4QG

8、Q7的兩條蛋白序列，分別命名為Small Brown Plant Hopper Toxin-1和Small BrownPlant Hopper Toxin-2，簡(jiǎn)稱(chēng)ST-1、ST-2。ST-1和ST-2兩個(gè)蛋白氨基酸序列之間具有51％的序列相似性。ST-2序列和Cry64Aa1、Cry33Aa1、Cry15Aa分別有45％、36％和31％的序列相似性。
　　3.高活性Bt新基因的功能驗(yàn)證
　　ST-1和ST-2兩個(gè)基因的異源

9、原核表達(dá)、純化與活性測(cè)定。利用pHT-1A載體，構(gòu)建3個(gè)重組質(zhì)粒，兩個(gè)質(zhì)粒分別包含ST-1、ST-2兩個(gè)基因，一個(gè)質(zhì)粒同時(shí)連入兩個(gè)基因進(jìn)行共表達(dá)。質(zhì)粒最終通過(guò)電擊轉(zhuǎn)化到Bt無(wú)晶體突變株HD73-，單獨(dú)存在的ST-1、ST-2基因并不表達(dá)，但兩個(gè)基因共表達(dá)成功。利用共表達(dá)的粗蛋白進(jìn)行生測(cè)(濃度分別為5.27和5.13μg/mL)，持續(xù)6d灰飛虱校正死亡率為90％。對(duì)提取的粗蛋白，先后經(jīng)過(guò)凝膠過(guò)濾層析及離子交換進(jìn)行純化，純化后的蛋白濃縮，透

10、析脫鹽后對(duì)灰飛虱及白背飛虱（Sogatella furcifera）進(jìn)行殺蟲(chóng)活性測(cè)定表明，兩蛋白對(duì)兩種試蟲(chóng)都表現(xiàn)出較高的殺蟲(chóng)活性，對(duì)灰飛虱的毒力回歸方程式為y=3.67x+3.62，對(duì)白背飛虱的毒力回歸方程為y=3.95x+2.99。利用SPSS Probit回歸計(jì)算LC50分別為3.15μg/g、2.14μg/g,95％置信區(qū)間分別為2.12-3.80μg/g、1.18-2.57μg/g。ST-1和ST-2在已知的Bt蛋白對(duì)半翅目昆蟲(chóng)

11、的活性研究中，僅次于Vip1/Vip2二元毒素，而對(duì)稻飛虱是目前發(fā)現(xiàn)的活性最高的Bt殺蟲(chóng)蛋白。ST-1和ST-2在濃度為300μg/g時(shí)，對(duì)鱗翅目二化螟（Chilosuppressalis）、小菜蛾（Plutella xylostella、鞘翅目大猿葉甲(Colaphellus bowringi均無(wú)殺蟲(chóng)活性，說(shuō)明蛋白的殺蟲(chóng)活性具有高度特異性。
　　研究表明，ST-1和ST-2同時(shí)包含ETX-MTX2結(jié)構(gòu)域，據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，ETX-MT

12、X2蛋白家族，以及Toxin_10家族的蛋白可能同時(shí)含有aerolysin中類(lèi)似的β折疊結(jié)構(gòu)，基于類(lèi)似的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)，推斷它們可能具有共同的成孔毒素的特性，而且對(duì)半翅目昆蟲(chóng)會(huì)有殺蟲(chóng)活性。研究結(jié)果填補(bǔ)了Bt蛋白對(duì)稻飛虱無(wú)高效殺蟲(chóng)活性的空白，拓展了Bt蛋白殺蟲(chóng)譜，將有望革新對(duì)半翅目害蟲(chóng)的防治手段，也為稻飛虱的綠色防控開(kāi)辟了新途徑。
　　4.基于中腸轉(zhuǎn)錄組的Bt受體及相關(guān)功能基因分析
　　灰飛虱中腸轉(zhuǎn)錄組測(cè)序與分析?；绎w虱中腸轉(zhuǎn)錄組經(jīng)

13、過(guò)去除低質(zhì)量reads，最后一共產(chǎn)生26，404，470條平均長(zhǎng)度90 bp的clean reads，經(jīng)過(guò)Trinity拼接后一共產(chǎn)生了31，435條scaffold，其中15792條(50％)同NCBI已知蛋白序列有顯著的相似性(Evalue＜10-5)并提交NCBI SRA數(shù)據(jù)庫(kù)accession number為SRX274939。對(duì)注釋后的基因進(jìn)行GO及COG分析，同時(shí)比較了灰飛虱全蟲(chóng)轉(zhuǎn)錄組，將表達(dá)量顯著高于全蟲(chóng)的灰飛虱中腸基因挑

14、出，進(jìn)行GO分析發(fā)現(xiàn)分子功能中有兩類(lèi)蛋白“Binding”和“Catalyticactivity”有最多的分類(lèi)數(shù)量，反映了中腸的生理功能，對(duì)食物的消化與轉(zhuǎn)運(yùn)，結(jié)合及催化活性有密切聯(lián)系。同時(shí)，在轉(zhuǎn)錄組中發(fā)現(xiàn)了Bt蛋白的常見(jiàn)受體，如Aminopeptidase N(APN),Alkaline phosphatase(ALP),Cadherin(CAD)等。研究結(jié)果為進(jìn)一步篩選對(duì)灰飛虱有殺蟲(chóng)活性的Bt新基因及受體基因，并明確其作用機(jī)理奠定了分

15、子生物學(xué)基礎(chǔ)。
　　魚(yú)尼丁受體基因(Ryanodine receptor，RyR)挖掘。利用灰飛虱、煙粉虱(Bemisia tabaci)，二化螟，小菜蛾和稻縱卷葉螟(Cnaphalocrocis medinalis)5種農(nóng)業(yè)昆蟲(chóng)的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)進(jìn)行RyR受體基因挖掘。通過(guò)RyR片段定位信息，設(shè)計(jì)引物擴(kuò)增基因片段，利用Rapid-amplification of cDNA ends(RACE)技術(shù)獲得末端片段序列，拼接所有獲得的序列成

16、為全長(zhǎng)基因。5個(gè)物種中獲得3條基因全長(zhǎng)，1個(gè)完整的開(kāi)放閱讀框序列，1個(gè)半長(zhǎng)序列。經(jīng)過(guò)Northern Blot驗(yàn)證了序列存在于mRNA轉(zhuǎn)錄本。對(duì)本研究獲得的RyR基因進(jìn)行了序列分析，克隆的基因序列包括了RyR基因的2個(gè)EF-Hand，6個(gè)跨膜區(qū)域，最終在羧基端成孔序列的附近發(fā)現(xiàn)了N4968、N4970、N4981、S5004、L5027、N5059和R5076，這7個(gè)鱗翅目害蟲(chóng)專(zhuān)有位點(diǎn)。鑒于二酰胺類(lèi)農(nóng)藥對(duì)鱗翅目昆蟲(chóng)有著高毒力，而且RyR