YvoA蛋白對蘇云金芽胞桿菌幾丁質(zhì)酶基因表達調(diào)控的研究.pdf

1、迄今為止，幾丁質(zhì)酶基因（chitinase， chi）表達調(diào)控在鏈霉菌中的研究和報道最為詳盡，然而包括蘇云金芽胞桿菌(Bacillus thuringiensis，簡稱Bt)在內(nèi)的芽胞桿菌幾丁質(zhì)酶基因的表達調(diào)控機制知之甚少。實驗室前期的研究對Bt75幾丁質(zhì)酶基因(chiA和chiB)上游序列進行一系列缺失突變，結(jié)果發(fā)現(xiàn)該序列中存在一個16bp的位點，與順式作用元件“dre”（多效調(diào)節(jié)因子DasR蛋白的應(yīng)答元件，該蛋白在鏈霉菌中可以調(diào)控幾

2、丁質(zhì)酶的表達）十分相似，缺失或者破壞這個位點導(dǎo)致原本誘導(dǎo)型表達的啟動子變?yōu)榻M成型表達。由此可見，該位點很有可能結(jié)合類似DasR的調(diào)節(jié)因子。通過氨基酸序列比對，發(fā)現(xiàn)在Bt中存在與枯草芽胞桿菌（Bacillus subtilis，簡稱Bs）YvoA（與DasR有40％的一致性）極為相似的蛋白編碼基因，因此我們推測該蛋白通過與dre位點的結(jié)合調(diào)控Bt幾丁質(zhì)酶基因的表達。
　　本研究克隆、表達、純化了Bt75的YvoA蛋白。凝膠電泳遷移率

3、變動分析(EMSA)、等溫滴定量熱法(ITC)、pull-down實驗均證實，純化的YvoA蛋白（大腸桿菌表達）能與含dre位點的40bp DNA序列特異性結(jié)合。其次，敲除Bt75菌株的yvoA基因，獲得的突變菌株Bt75△yvoA與原始菌株相比在基礎(chǔ)培養(yǎng)基中的幾丁質(zhì)酶活力升高7.1倍，且?guī)锥≠|(zhì)酶基因的表達由誘導(dǎo)型變?yōu)榻M成型;幾丁質(zhì)酶基因的chiA mRNA的相對表達量提高1.5倍，chiB提高6.7倍。至此，可以確定YvoA蛋白作為轉(zhuǎn)

4、錄調(diào)控因子通過與dre位點的結(jié)合抑制蘇云金芽胞桿菌幾丁質(zhì)酶基因的表達。
　　通過PREDetector軟件分析發(fā)現(xiàn)蘇云金芽胞桿菌基因組中還存在其它的dre位點，如核糖核酸酶Z（Ribonuclease Z）基因(-99～-114)、青霉素結(jié)合蛋白(Penicillin-binding protein)基因(-63～-78)和ABC轉(zhuǎn)運子ATP結(jié)合蛋白(ABCtransporter ATP-binding protein)基因（-8

5、1～-96）的上游調(diào)控區(qū)都發(fā)現(xiàn)有類似dre位點的序列。Real-time PCR證實突變菌株Bt75△yvoA中3個基因的mRNA相對表達量都有不同程度的提高，EMSA證實YvoA蛋白可與這3個基因上游含dre位點的序列特異結(jié)合。因此，結(jié)合體內(nèi)（in vivo）、體外（in vitro）和電腦分析（in silico）的結(jié)果，可以得出YvoA蛋白的作用不僅僅局限于調(diào)控GlcNAc的代謝，還可能參與其它基因的表達調(diào)控。
　　此外，E