蘇云金芽胞桿菌G03的芽胞形成相關(guān)基因?qū)ry基因表達的影響.pdf

1、蘇云金芽胞桿菌(Bacillus thuringiensis,簡稱Bt)因其殺蟲效果好、安全、高效等優(yōu)點而成為應(yīng)用最為廣泛的殺蟲微生物.Bt與其它芽胞桿菌相比,一個顯著特點就是不僅能夠形成芽胞,同時還能產(chǎn)生由殺蟲蛋白組成的晶體.在模式芽胞桿菌枯草桿菌中有關(guān)芽胞形成的相關(guān)基因研究較深入,而Bt晶體形成機制方面的研究主要是集中在殺蟲晶體蛋白基因的表達調(diào)控,有關(guān)晶體形成與芽胞形成相關(guān)基因關(guān)系的研究報道極少.本研究利用蘇云金芽胞桿菌全基因組序列

2、,初步研究了芽胞形成相關(guān)基因與殺蟲蛋白基因表達、調(diào)控的相互關(guān)系. 利用攜帶.Mini-Tn10轉(zhuǎn)座子的plC333構(gòu)建了B.thuringiensis G03的轉(zhuǎn)座子突變體庫,獲得了50,000株具有壯觀霉素抗性的突變體.篩選獲得一株不能產(chǎn)生芽胞和晶體的突變株,命名為G03(spoⅢAE):Mini-Tn10.分析Mini-Tn10轉(zhuǎn)座子兩端的側(cè)翼序列確定了插入位點位于spoⅢAE基因的前端,并造成了9個堿基的重復(fù).Southern b

3、lotting分析表明,Mini-Tn10轉(zhuǎn)座子在染色體上只有一個插入位點.SDS-PAGE分析表明晶體蛋白的表達由于spoⅢAE基因的失活而受到嚴重影響. 已知編碼晶體蛋白的cry基因是sigmaE、sigmaK因子共同控制轉(zhuǎn)錄的,而且sigmaE因子發(fā)揮主要作用,據(jù)此推測sigmaE因子的活性有可能因spoⅢAE基因的失活而降低.枯草芽胞桿菌作為芽胞桿菌的模式菌,其芽胞形成的級聯(lián)調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中,spoⅢAE基因的轉(zhuǎn)錄是由上游的

4、sigmaE因子控制的,SpoⅢAE蛋白則是激活下游的sigmaK因子所必需的,過去未見SpoⅢAE蛋白影響sigmaE因子活性的報道.為進一步分析Bt芽胞與晶體形成相關(guān)基因調(diào)控的相互作用與特點,我們又開展了下面的研究. 構(gòu)建了spoⅢAE基因的敲除載體pRAE,然后導(dǎo)入G03菌株,通過高溫誘導(dǎo)突變獲得了spoⅢAE基因的缺失突變株CAB(spoⅢAE△).該突變株不能產(chǎn)生芽胞和晶體,SDS-PAGE分析表明只能產(chǎn)生少量的殺蟲

5、蛋白.克隆了G03 crylAa基因的啟動子,并構(gòu)建了攜帶cry.Ma′-′lacZ的表達載體pHTcrylAa.然后將載體pHTcrylAa分別導(dǎo)入出發(fā)菌株G03和突變株G03(spollIAE)::Mini-Tn10、G03(spⅢAE△)中,轉(zhuǎn)錄分析表明兩突變株中的crylAa基因活性嚴重降低.克隆G03菌株中由sigmaE直接調(diào)控的spollD基因的啟動子,構(gòu)建了攜帶spoⅡD′-′lacZ的表達載體pHTspoⅡD.將載體pH

6、TspoⅡD分別導(dǎo)入出發(fā)菌株G03和突變株G03(spoⅢAE):Mini-Tn10、G03(ispoⅢAE△)中,轉(zhuǎn)錄分析表明spoⅡD基因的活性顯著降低,說明spoⅢAE基因的敲除嚴重降低了sigmaE因子的活性.以上結(jié)果說明spoⅢAE基因的失活導(dǎo)致Bt菌株不產(chǎn)生殺蟲晶體,是由于spoⅢAE基因為sigmaE因子維持高活性所必需.在芽胞形成中spoⅢAE基因?qū)igmaE因子存在一種反向正調(diào)節(jié)作用,它的缺失導(dǎo)致sigmaE因子活性

7、降低,從而導(dǎo)致crylAa基因的活性降低. 為證實spoⅢAE基因的下游基因缺失是否影響sigmaE因子活性,我們對直接參與sigmaK因子激活的spoⅣF操縱子進行了以下研究.構(gòu)建了.spoⅣF操縱子的敲除載體pRⅣF,敲除spoⅣF操縱子獲得了突變株G03(spoⅣF△).該突變株也喪失了產(chǎn)生芽胞和晶體的能力,SDS-PAGE分析表明突變株G03(spoⅣF△)的殺蟲蛋白產(chǎn)量也非常低.為了驗證spoⅣF操縱子的功能,構(gòu)建了

8、恢復(fù)載體pSⅣF進行了功能互補實驗.結(jié)果表明部分恢復(fù)了突變株G03(spoⅣF△)產(chǎn)生芽胞和形成晶體的能力.將載體pHTcrylAa和pHTspollD分別導(dǎo)入突變株G03(spoIVFA),轉(zhuǎn)錄分析表明crylAa和spollD基因的活性顯著降低,說明splIVD操縱子缺失也可導(dǎo)致sigmaE因子的活性降低,進而影響crylAa基因的表達.殺蟲蛋白表達量的SDS.PAGE分析發(fā)現(xiàn)與spolllAE基因相比,splIVF操縱子對sigm