蘇云金芽胞桿菌新型cry1基因克隆、表達(dá)及活性分析.pdf

1、蘇云金芽胞桿菌(Bt)是一種世界上應(yīng)用廣泛的生防微生物,它具有高度的殺蟲特異性和對人畜無害的優(yōu)點(diǎn)。主要的殺蟲成份是殺蟲晶體蛋白,由cry和cyt基因編碼。其中cryl類基因的表達(dá)產(chǎn)物對多種鱗翅目害蟲具有較高的殺蟲活性,但是由于檢測方法的局限性,快速、準(zhǔn)確地鑒定已知和未知基因有一定的難度。為了充分發(fā)掘Bt菌株中cryl類基因資源,本研究建立了一個(gè)高分辨率的篩選cryl類基因的PCR-RFLP方法。通過生物信息學(xué)軟件對cryl類模式基因進(jìn)行

2、聚類分析,根據(jù)全長基因的5’及3’端差異將cryl類基因分成4個(gè)大類,分別設(shè)計(jì)通用引物,酶切分析只需要區(qū)分一個(gè)大類中的幾個(gè)基因,提高了分辨率。該方法可以快速、準(zhǔn)確、有效地對Bt菌株中的cryl類基因進(jìn)行分型,特別是可以檢測出已知及新型的cryl類基因。
　　 通過原有的cryl類基因PCR-RFLP鑒定方法和新建立的體系對3株含有多種cryl類基因的Bt菌株進(jìn)行了鑒定,發(fā)現(xiàn)原有體系在cryl類基因較多時(shí)無法準(zhǔn)確檢測,而且不能確定

3、是否含有crylI類基因,而新的體系對3株Bt菌株都達(dá)到了準(zhǔn)確鑒定的目的,并且發(fā)現(xiàn)了一些國內(nèi)還沒有報(bào)道過的基因型,如crylHb、crylJa、crylKa、crylLa等。新體系不僅適用于單基因樣品的分型,也適用于一株菌株中含有多個(gè)基因的樣品的分型。
　　 應(yīng)用新建立的平臺對72株蘇云金芽胞桿菌標(biāo)準(zhǔn)菌株和86株Bt野生菌株進(jìn)行cryl類基因型的鑒定,發(fā)現(xiàn)標(biāo)準(zhǔn)菌株中有11株含有cryl類基因,而野生菌株中絕大部分都含有cryl類

4、基因,從中選取了19個(gè)cryl新基因。另外根據(jù)Bt標(biāo)準(zhǔn)菌株T038001的全基因組測序結(jié)果,發(fā)現(xiàn)了兩個(gè)cryl新基因。
　　 根據(jù)這些基因的全長序列設(shè)計(jì)擴(kuò)增cryl類基因的全長引物,成功克隆上述基因,除crylNa外,20個(gè)cryl基因被國際Bt命名委員會正式命名為crylAa16、crylAb23,crylAb24,crylAh3、crylAi2、crylBa7、crylBb2、crylBe4,crylCa12、crylDa3

5、、crylEa9、crylFa3、crylFa4,crylHb2、crylIa19,crylIb5,crylIe2、crylJa2,crylKa2、crylLa2。利用表達(dá)載體pEB在大腸桿菌Rosetta(DE3)中對這些基因進(jìn)行表達(dá),表達(dá)產(chǎn)物為60-130kDa左右的蛋白。除Cry1Ka2和Cry1La2兩種蛋白外,其它的Cryl蛋白都對敏感小菜蛾有毒力。沒有活性報(bào)道的CrylHb蛋白對小菜蛾和棉鈴蟲都有毒力,LC50分別為305.

6、82(241.66-391.76)μg/mL和315.12(225.68-456.86)μg/mL。CrylBa7和CrylEa9兩種蛋白對大猿葉甲有較高的毒力,LC50分別為5.21(3.84-8.65)μg/mL和55.78(43.40-88.42)μg/mL,其中CrylEa對鞘翅目害蟲的活性未見報(bào)道。CrylCa12對甜菜夜蛾有較高的毒力,LC50為89.11(60.54-121.26)x10-3μg/mL。CryIIe2和Cr