蘇云金芽胞桿菌新型cry9基因克隆、表達(dá)及活性分析.pdf

1、蘇云金芽胞桿菌（Bacillusthuringiensis，Bt）是一種世界上應(yīng)用廣泛的生防微生物，它具有高度的殺蟲(chóng)特異性和對(duì)人畜無(wú)害的優(yōu)點(diǎn)。主要的殺蟲(chóng)成份是殺蟲(chóng)晶體蛋白，其由cry和cyt基因編碼。其中cry9類(lèi)基因的表達(dá)產(chǎn)物對(duì)鱗翅目多種害蟲(chóng)具有較高的殺蟲(chóng)活性，但是由于檢測(cè)方法的局限性，發(fā)現(xiàn)的基因種類(lèi)不多，活性高的基因更少。為了充分發(fā)掘Bt菌株中cry9類(lèi)基因資源，本研究建立了一種基于PCR產(chǎn)物，利用高分辨熔解曲線(xiàn)（highresol

2、utionmeltingHRM）進(jìn)行cry9類(lèi)基因分型的方法。根據(jù)所有已報(bào)道的cry9類(lèi)基因的保守區(qū)設(shè)計(jì)一對(duì)擴(kuò)增片段為100bp的通用鑒定引物，利用高分辨熔點(diǎn)儀對(duì)產(chǎn)物的熔解曲線(xiàn)進(jìn)行分析，由于擴(kuò)增產(chǎn)物的堿基組成不同，不同類(lèi)型的基因產(chǎn)生不同的熔解曲線(xiàn)，從而將樣品進(jìn)行基因分類(lèi)。該方法可以高通量地進(jìn)行基因分型，特別是可以檢測(cè)出已知及新型的cry9類(lèi)基因。
　　 本研究利用PCR方法鑒定菌株SC5-D2和SC5-E8中分別含有cry9Aa

3、和cry9Ea基因，以上述兩個(gè)cry9類(lèi)基因作為標(biāo)準(zhǔn)樣品對(duì)該方法進(jìn)行了驗(yàn)證。應(yīng)用建立的HRM平臺(tái)對(duì)72株蘇云金芽胞桿菌標(biāo)準(zhǔn)菌株進(jìn)行cry9類(lèi)基因型的鑒定，PCR陽(yáng)性的有3株。根據(jù)熔解曲線(xiàn)發(fā)現(xiàn)B.thuringiensissubsp.fukuokaensis（T03C001）含有cry9Aa基因片段，B.thuringiensissubsp.sumiyoshiensis（T038001）含有cry9Da和兩個(gè)新型cry9類(lèi)基因片段，B.t

4、huringiensissubsp.japonensis（T23001）含有cry9Da基因片段。以上述cry9基因片段為標(biāo)準(zhǔn)樣品應(yīng)用HRM平臺(tái)對(duì)2000株分離株進(jìn)行cry9類(lèi)基因型的鑒定，PCR陽(yáng)性的有273株，熔解曲線(xiàn)類(lèi)型為20類(lèi)，經(jīng)測(cè)序分析其中菌株SC5.D4菌株中含有cry9Ba基因。
　　 根據(jù)這些基因的全長(zhǎng)序列設(shè)計(jì)擴(kuò)增cry9類(lèi)基因的全長(zhǎng)引物，成功克隆上述基因，并被國(guó)際Bt命名委員會(huì)正式命名為cry9Aa3，cry9

5、Ea8，cry9Aa4，cry9Da3，cry9Da4，cry9Eb2。cry9Ee1，cry9Ba3。利用表達(dá)載體pEB在大腸桿菌Rosetta（DE3）對(duì)這些基因進(jìn)行表達(dá)，表達(dá)產(chǎn)物均為130kDa左右的蛋白（Cry9Ba3未表達(dá)）。Cry9Aa3，Cry9Aa4，Cry9Eb2，Cry9Ee1對(duì)鱗翅目害蟲(chóng)小菜蛾殺蟲(chóng)活性較高，LC50分別為1.83μg/mL、1.90μg/mL、1.03μg/mL和1.70μg/mL；且上述四個(gè)蛋白對(duì)

6、CrylAc抗性小菜蛾毒力較高，LC50分別為1.39μg/mL、1.74μg/mL、1.24μg/mL和1.45μg/mL。表明四種Cry9蛋白在小菜蛾的毒力上與Cry1Ac都沒(méi)有交互抗性。而Cry9Ea8，Cry9Da3，Cry9Da4對(duì)小菜蛾無(wú)活性。Cry9Aa3，Cry9Aa4，Cry9Eb2，Cry9Ee1對(duì)另一種鱗翅目害蟲(chóng)亞洲玉米螟殺蟲(chóng)活性較好，LC50分別為6.93μg/mL、1.06μg/mL、5.93μg/mL和2.2