蘇云金芽胞桿菌γ-氨基丁酸代謝旁路相關(guān)基因簇的結(jié)構(gòu)與功能研究.pdf

1、蘇云金芽胞桿菌 (Bacillus thuringiensis,簡稱Bt) 因其殺蟲效果好、安全、高效等優(yōu)點而成為農(nóng)業(yè)生物防治上應(yīng)用最為廣泛的殺蟲微生物.Bt與其它芽胞桿菌相比,一個顯著特點就是在形成芽胞的同時,還能產(chǎn)生由殺蟲蛋白組成的伴胞晶體.有關(guān)Bt伴胞晶體形成機制方面的研究主要是集中在殺蟲晶體蛋白基因的表達(dá)調(diào)控上,而從代謝調(diào)控的角度研究晶體蛋白形成的分子機制目前尚未見報道.本論文圍繞蘇云金芽胞桿菌中與γ-氨基丁酸代謝旁路相關(guān)基因簇

2、的結(jié)構(gòu)和功能進(jìn)行了一系列的研究,主要內(nèi)容包括: 本研究從國內(nèi)分離得到的蘇云金芽胞桿菌G03菌株中克隆了gabT 和 gabD 基因,并分別在大腸桿菌中進(jìn)行了表達(dá)和純化.酶活測定結(jié)果表明,GabT和GabD蛋白分別呈現(xiàn)出γ-氨基丁酸轉(zhuǎn)氨酶和琥珀酸半醛脫氫酶的活性.氨基酸序列同源性比對分析發(fā)現(xiàn),這兩個蛋白質(zhì)在蠟樣芽胞桿菌群(B.cereus group)中具有較高的相似性,而與枯草芽胞桿菌的相似性較低,分別為58﹪、51﹪.

3、 利用基因敲除技術(shù)分別構(gòu)建了Bt HD-73菌株的gabT、gabD基因缺失突變株,同時也構(gòu)建了相應(yīng)的回復(fù)突變株,對gabT、gabD基因的功能進(jìn)行了研究,結(jié)果表明:gabT、gabD基因敲除不會影響突變株在豐富培養(yǎng)基中的正常生長,但在基礎(chǔ)培養(yǎng)基(含0.2﹪GABA)中g(shù)abT基因缺失突變株的生長會受到抑制:gabT、gabD基因敲除對晶體蛋白的表達(dá)量無顯著影響,但gabT的缺失會推遲晶體蛋白的表達(dá):gabT、gabD基因敲除均會導(dǎo)致芽

4、胞產(chǎn)量的降低;GABA代謝旁路的功能還有待于進(jìn)一步了解. 通過對Bt HD-73菌株gab基因簇的克隆及序列分析發(fā)現(xiàn),gab基因簇的結(jié)構(gòu)與大腸桿菌和枯草芽胞桿菌的明顯不同,而在蠟樣芽胞桿菌群中基本上是一致的,說明γ-氨基丁酸代謝途徑相關(guān)的基因簇結(jié)構(gòu)在蠟樣芽胞桿菌群中是比較保守的.通過RT-PCR.轉(zhuǎn)錄分析發(fā)現(xiàn)gabD和gabT基因并未同時進(jìn)行轉(zhuǎn)錄,其中g(shù)abT單獨轉(zhuǎn)錄,而gabD與其上游的轉(zhuǎn)錄激活因子編碼基因reg共轉(zhuǎn)錄.根據(jù)克

5、隆并測序的gab基因簇序列,分別克隆了gabT和reg基因的啟動子,并構(gòu)建了相應(yīng)的lacZ融合表達(dá)載體.通過β-半乳糖苷酶活性的定性和定量分析,表明gabT和reg基因的轉(zhuǎn)錄都是由自身的啟動子調(diào)控的.以上研究結(jié)果表明gabT'和gabD基因?qū)儆诓煌霓D(zhuǎn)錄單元,而gabD和reg基因組成了一個操縱子. 利用敲除載體pMADDreg通過同源重組方法敲除reg基因后獲得缺失突變株HD-73(△reg).發(fā)現(xiàn)突變菌株的生長、產(chǎn)芽胞和晶體

6、蛋白的能力與出發(fā)菌株相比并無明顯差異.但reg基因的缺失嚴(yán)重地影響了SSADH酶活性,并通過其回復(fù)突變株恢復(fù)了SSADH酶活性,說明reg基因?qū)abD基因的表達(dá)起正調(diào)控作用.同樣地,發(fā)現(xiàn)reg 基因?qū)abT基因的表達(dá)也起正調(diào)控作用.通過對reg基因的表達(dá)產(chǎn)物Reg蛋白的結(jié)構(gòu)域分析,推測它可能是一種依賴丁σ<'54>因子的激活蛋白,在蠟樣芽胞桿菌群中比較保守,有關(guān)其調(diào)控作用需進(jìn)一步的驗證. 總之,本研究為深入研究蘇云金芽胞桿菌