蘇云金芽胞桿菌絲氨酸蛋白激酶的功能研究.pdf

1、蘇云金芽胞桿菌(Bacillus thuringiensis)為革蘭氏陽性細(xì)菌，在土壤中廣泛存在。與其它芽胞桿菌不同的是其在生長(zhǎng)過程中會(huì)伴隨芽胞的形成而產(chǎn)生具有特異毒性的殺蟲晶體蛋白，目前已發(fā)現(xiàn)對(duì)有害生物具有毒殺作用的蘇云金芽胞桿菌就有上千種。
　　 根據(jù)不同生長(zhǎng)時(shí)期蘇云金芽胞桿菌YBT-1520比較蛋白質(zhì)組研究，在蘇云金芽胞桿菌穩(wěn)定期后期有一種絲氨酸蛋白激酶(PrkA)大量表達(dá)，并且表現(xiàn)出明顯的磷酸化圖譜，而蘇云金芽胞桿菌的芽

2、胞和伴胞晶體也是在穩(wěn)定期中后期才形成的，因此推斷PrkA蛋白與蘇云金芽胞桿菌芽胞和伴胞晶體合成有密切關(guān)系。PrkA蛋白最早在枯草芽胞桿菌中分離得到，只檢測(cè)到絲氨酸蛋白磷酸化活性，其生物學(xué)功能尚未明了，因此通過對(duì)PrkA蛋白進(jìn)行功能驗(yàn)證，期望揭示PrkA在蘇云金芽胞桿菌的代謝活動(dòng)中所參與的調(diào)控作用，同時(shí)揭示PrkA對(duì)蘇云金芽胞桿菌芽胞的形成及殺蟲晶體蛋白表達(dá)之間的關(guān)系，以求對(duì)伴胞晶體的形成機(jī)制有更加深入的了解。
　　 1.本課題是

3、對(duì)PrkA蛋白進(jìn)行功能驗(yàn)證，首先通過PrkA過表達(dá)實(shí)驗(yàn)對(duì)過表達(dá)菌株和野生株進(jìn)行生理特性比較，發(fā)現(xiàn)PrkA過表達(dá)菌株較野生株其菌液不易出現(xiàn)沉降現(xiàn)象，且其芽胞和伴胞晶體的形成時(shí)間提前。
　　 2.PrkA的motif搜索結(jié)果發(fā)現(xiàn)其含有Sigma-54 interaction domain，因而需要對(duì)PrkA與Sigma54進(jìn)行互作驗(yàn)證，驗(yàn)證通過GST pull-down技術(shù)和細(xì)菌雙雜交技術(shù)完成，經(jīng)驗(yàn)證PrkA與Sigma54之間無相

4、互作用。
　　 3.為了尋找與PrkA互作的蛋白，首先將prkA目的基因插入表達(dá)載體pGEX構(gòu)建原核表達(dá)載體質(zhì)粒，再轉(zhuǎn)化大腸桿菌表達(dá)菌株BL21表達(dá)純化GST-PrkA融合蛋白;然后通過GST pull-down技術(shù)和雙向電泳實(shí)驗(yàn)尋找可能與PrkA存在相互作用的蛋白，對(duì)特異蛋白條帶進(jìn)行質(zhì)譜鑒定;最后，對(duì)質(zhì)譜鑒定得到的九種蛋白進(jìn)行功能分析，猜測(cè)菌液沉降實(shí)驗(yàn)與PrkA對(duì)GGDEF family protein的調(diào)節(jié)有關(guān)，而芽胞和伴胞