豬Sp110基因的分子特征、選擇性剪接和亞細(xì)胞定位.pdf

1、國內(nèi)外研究發(fā)現(xiàn)，Sp110基因參與機(jī)體的特異性免疫應(yīng)答和抗病毒反應(yīng)，是與人體肺結(jié)核病易患性相關(guān)的一個(gè)候選基因，在細(xì)胞中具有轉(zhuǎn)錄激活因子的作用。該基因在人上研究較多，尚未見有關(guān)豬Sp110基因的研究報(bào)告，本研究以豬Sp110基因?yàn)檠芯繉ο?，利用克隆測序等分子生物學(xué)方法克隆豬Sp110基因cDNA序列及其變異剪接體;采用Minigene技術(shù)深入分析其變異剪接情況;采用脂質(zhì)體介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染方法對豬Sp110基因進(jìn)行亞細(xì)胞定位分析;并利用Real

2、time PCR方法檢測豬Sp110基因的組織表達(dá)和誘導(dǎo)表達(dá)情況。本試驗(yàn)研究結(jié)果如下:
　　(1)首次成功克隆了豬Sp110基因cDNA序列，獲得27條變異剪接體(GenBank accessionNos.KC811303-27、KF898045、JX280458)，其中變異剪接體V26最長，我們將其作為reference(R)序列，相對于R，其他變異剪接體都是序列缺失形成的。R擴(kuò)增全長2016 bp，含有11bp5'-非翻譯區(qū)(

3、Untranslated region，UTR)、1950 bpCDS區(qū)和55 bp3'-UTR，預(yù)期編碼649個(gè)氨基酸。與R相比，V、V1、V5、V6、V9、V14、V20和V22為缺失突變;其余均為移碼突變，導(dǎo)致翻譯提前終止。
　　(2)利用外顯子3、14和15構(gòu)建Minigene載體，在該區(qū)域內(nèi)尋找到7種新的變異剪接方式(NV1-7)，NV1/5/6均由外顯子3和15的部分序列組成，但剪接位點(diǎn)(Splice sites，SS

4、s)各不相同;NV2由完整的外顯子3和15組成;NV3和NV4由外顯子3、14和15組成，其中NV4含有完整的外顯子14，而NV3的外顯子14缺失17bp; NV7由NV2的5'端和NV1的3'端組成，中間含有15bp的內(nèi)含子14序列。
　　(3)亞細(xì)胞定位分析結(jié)果顯示只有變異剪接體R和V定位在細(xì)胞核內(nèi)，其他變異剪接體喪失了核定位能力;進(jìn)一步對截短突變體分析，表明核定位序列(Nuclear localizationsequence

5、，NLS)位于變異剪接體R的250-280 aa處;生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)254-279 aa(KKGKKKKRCIWATPKRRHKKKCLPRE)為NLS。
　　(4) RT-qPCR表明變異剪接體R和V存在著相似的組織表達(dá)譜:均普遍表達(dá)于所檢測的各組織中，其中脾臟組織中表達(dá)量最高;在Poly(I∶C)的刺激下其表達(dá)量都增加且反應(yīng)相似;此外，二者具有相似的半衰期。但競爭性RT-PCR分析表明，在各組織中R的表達(dá)量均高于V。這些結(jié)果