Basigin選擇性剪接體的鑒定及其在肝癌增殖和侵襲中的功能.pdf

1、真核生物能從有限的基因中轉(zhuǎn)錄翻譯出大量mRNA和蛋白異構(gòu)體，其主要機(jī)制就是mRNA前體的選擇性剪接。選擇性剪接是一種普遍的現(xiàn)象，35％～60％的人類基因均受選擇性剪接的調(diào)控。選擇性剪接不但可以通過改變蛋白編碼序列來影響蛋白的結(jié)構(gòu)和功能，還可以通過引入未成熟終止密碼子激活NMD機(jī)制來調(diào)節(jié)mRNA水平。選擇性啟動(dòng)子是真核基因多樣性的另一重要機(jī)制，使mRNA具有不同的轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)和選擇性第一外顯子，從而影響mRNA的轉(zhuǎn)錄、翻譯并改變蛋白質(zhì)氨基

2、端結(jié)構(gòu)。選擇性剪接合并選擇性啟動(dòng)子，既能調(diào)控蛋白異構(gòu)體的結(jié)合活性、細(xì)胞定位、酶活性、蛋白穩(wěn)定性，還可以調(diào)節(jié)基因表達(dá)的組織特異性和表達(dá)水平，有著重要的生物學(xué)意義。選擇性剪接異常與多種疾病特別是腫瘤密切相關(guān)，通過調(diào)節(jié)剪接調(diào)控因子、癌基因的激活、抑癌基因的失活、細(xì)胞周期和細(xì)胞凋亡等過程，影響腫瘤細(xì)胞的增殖、運(yùn)動(dòng)、侵襲和耐藥。
　　腫瘤間質(zhì)是腫瘤細(xì)胞賴以生存的基礎(chǔ)?；|(zhì)金屬蛋白酶（MMPs）是最重要的腫瘤-間質(zhì)相互作用介導(dǎo)分子之一，能降解

3、細(xì)胞外基質(zhì)，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞侵襲。目前發(fā)現(xiàn)MMPs的表達(dá)主要受到basigin調(diào)控。Basigin又名EMMPRIN、OK血型抗原、CD147。我們實(shí)驗(yàn)室對(duì)此分子進(jìn)行了長期的研究，并將其命名為HAb18G/CD147。Basigin是一種高度糖基化的單次跨膜糖蛋白，屬于免疫球蛋白超家族粘附分子成員。Basigin由位于染色體19p13.3上的BSG基因編碼，其表達(dá)受Sp1、AP-2等轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控。Basigin具有多種生物學(xué)功能，參與組織修

4、復(fù)、生殖發(fā)育和能量代謝等過程。Basigin在腫瘤中表達(dá)上調(diào)，能通過誘導(dǎo)MMPs表達(dá)、降解ECM，促進(jìn)腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移。Basigin目前已被作為一種新的腫瘤標(biāo)志物，是一個(gè)理想的腫瘤治療靶點(diǎn)。
　　Basigin的轉(zhuǎn)錄也同樣受選擇性剪接的調(diào)控，目前已發(fā)現(xiàn)有basigin-1、basigin-2、basigin-3和basigin-4四種剪接變異體，分別編碼相應(yīng)的蛋白異構(gòu)體。其中basigin-2是最主要的剪接形式，其本質(zhì)就是目前研究比

5、較清楚的basigin分子，編碼basigin/CD147/EMMPRIN蛋白。而對(duì)另外3種變異體的基因結(jié)構(gòu)和功能研究較少。Basigin-1是一種視網(wǎng)膜特異性的具有3個(gè)Ig結(jié)構(gòu)域的異構(gòu)體，可能與感光細(xì)胞能量代謝有關(guān)。關(guān)于basigin-3和basigin-4的報(bào)道更少，對(duì)其表達(dá)和功能目前尚不明確。因此研究basigin的選擇性剪接變異體及其蛋白異構(gòu)體的特性、剪接機(jī)制、轉(zhuǎn)錄調(diào)控、表達(dá)分布、區(qū)別與basigin-2的獨(dú)特功能，將有助于我們

6、更系統(tǒng)的認(rèn)識(shí)basigin家族的生物學(xué)功能及其在腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移中的作用，對(duì)于深入理解腫瘤轉(zhuǎn)移的分子機(jī)制和發(fā)現(xiàn)新的腫瘤治療靶點(diǎn)均有著重要的意義。
　　本研究旨在全面系統(tǒng)的研究basigin各種選擇性剪接變異體的剪接模式、表達(dá)調(diào)控、組織分布、蛋白結(jié)構(gòu)、細(xì)胞定位，并參照basigin-2研究其他蛋白異構(gòu)體在肝細(xì)胞肝癌中功能及其可能的分子機(jī)制。研究分為四個(gè)部分：
　　第一部分：Basigin選擇性剪接變異體的表達(dá)、剪接模式和組織分布

7、。我們首先使用變異體特異性PCR檢測(cè)了basigin變異體在10種常見組織來源的腫瘤及正常細(xì)胞系cDNA中的表達(dá)，結(jié)果只有basigin-2、basigin-3和basigin-4能被擴(kuò)增出來。接著我們使用RACE法克隆了basigin-3和basigin-4的cDNA全長序列，發(fā)現(xiàn)其兩者有相同的轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)，位于basigin-2的轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)上游1227nt。采用熒光素酶報(bào)告系統(tǒng)，我們?cè)赽asigin-3/4上游-656～-473區(qū)

8、域內(nèi)鑒定到一個(gè)選擇性啟動(dòng)子，并受到Sp1等轉(zhuǎn)錄因子的調(diào)控。由此我們可以得出結(jié)論，BSG基因的轉(zhuǎn)錄同時(shí)受到選擇性啟動(dòng)子和選擇性剪接的雙重調(diào)控，由10個(gè)外顯子拼接出4種轉(zhuǎn)錄本。最后我們使用Taqman定量PCR檢測(cè)了basigin轉(zhuǎn)錄本的組織分布，發(fā)現(xiàn)它們廣泛表達(dá)于人體各組織，在部分組織中表達(dá)較高，同時(shí)還發(fā)現(xiàn)在肝癌組織中basigin-2和basigin-3的表達(dá)顯著上調(diào)。
　　第二部分：Basigin蛋白異構(gòu)體的表達(dá)。我們首先構(gòu)建了

9、GFP融合的basigin異構(gòu)體穩(wěn)定表達(dá)的肝癌細(xì)胞系，通過使用GFP抗體以及basigin異構(gòu)體特異性抗體，我們確定basigin變異體mRNA可以翻譯出相應(yīng)的蛋白，這些蛋白存在糖基化修飾，并能定位到細(xì)胞膜上。同時(shí)我們使用RNA干涉等方法驗(yàn)證了細(xì)胞內(nèi)源性basigin-3的表達(dá)。因此，在蛋白水平上能發(fā)揮功能的可能主要是basigin-2和basigin-3。而basigin-1具有視網(wǎng)膜特異性，basigin-4表達(dá)水平過低，因此在培養(yǎng)

10、細(xì)胞中均難以檢測(cè)到這兩種異構(gòu)體。
　　第三部分：Basigin蛋白異構(gòu)體的體外、體內(nèi)生物學(xué)功能。Basigin-2的功能目前比較清楚，在這一部分我們主要以basigin-2為參照，研究了basigin-3在肝癌增殖和侵襲中的功能。我們?cè)隗w外進(jìn)行了MTT增殖實(shí)驗(yàn)、劃痕實(shí)驗(yàn)、明膠酶譜、Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)，結(jié)果均表明basigin-3具有與basigin-2相反的功能，能夠抑制肝癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲。為進(jìn)一步驗(yàn)證basigi

11、n-3的功能，我們又進(jìn)行了動(dòng)物體內(nèi)實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)在裸鼠原位肝癌模型中，basigin-3同樣能夠在體內(nèi)抑制肝癌的增殖和侵襲。這些結(jié)果均提示，basigin-3與已知的basigin-2的功能相反，可能是baisigin-2的內(nèi)源性抑制劑。
　　第四部分：Basigin蛋白異構(gòu)體間的相互作用。在這一部分我們主要探索了basigin-3發(fā)揮抑制功能的分子機(jī)制。Basigin-2的寡聚化是其發(fā)揮功能的重要因素，而basigin-3本質(zhì)上是b

12、asigin-2的N端截短，具有高度同源性，兩者之間也可能存在相互作用。為驗(yàn)證這一推測(cè)，我們首先進(jìn)行了雙分子熒光互補(bǔ)實(shí)驗(yàn)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)basigin-3和basigin-2確實(shí)存在相互作用。然后我們又進(jìn)行了NMR分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)basigin-3和basigin-2的相互作用界面位于近膜端的IgI結(jié)構(gòu)域，通過該區(qū)域部分殘基的相互作用，兩者可以發(fā)生聚合。Basigin-3和basigin-2發(fā)生異源二聚，可能是其發(fā)揮抑制功能的分子基礎(chǔ)。Basi

13、gin-3缺少具有誘導(dǎo)MMPs分泌的IgC2結(jié)構(gòu)域，可能具有顯性失活（dominantnegative）效應(yīng)，與basigin-2結(jié)合后，抑制了basigin-2的誘導(dǎo)MMPs的功能，從而使抑制了肝癌的增殖和侵襲。
　　綜上所述，本研究全面的闡明了BSG基因的選擇性剪接及其蛋白異構(gòu)體的功能。BSG基因具有10個(gè)外顯子，在兩個(gè)啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄下，經(jīng)外顯子跨越/保留機(jī)制，產(chǎn)生出4中basigin剪接變異體。除了視網(wǎng)膜特異性的basigin

14、-1外，其他3種廣泛表達(dá)于人體各種組織中，且在肝癌中表達(dá)上調(diào)。Basigin剪接變異體均能翻譯出相應(yīng)的蛋白異構(gòu)體，但只有廣泛表達(dá)的basigin-2和basigin-3是主要的功能蛋白。與basigin-2促腫瘤增殖、侵襲的功能相反，basigin-3在體外和體內(nèi)均能夠抑制肝癌的增殖和侵襲。這種抑制作用可能是由于basigin-3和basigin-2發(fā)生異源二聚，發(fā)揮顯性失活效應(yīng)，阻斷basigin-2誘導(dǎo)MMPs的產(chǎn)生。Basigin