ELMO2在肝癌細胞遷移運動和侵襲中的功能.pdf

1、肝癌是威脅人類健康的主要疾病之一，尤其在中國有較高的發(fā)病率，對于其研究有重要意義。腫瘤轉(zhuǎn)移是導(dǎo)致惡性腫瘤患者死亡的主要原因，至今沒有找到理想的治療手段和方法。ELMOs廣泛表達于哺乳動物細胞，主要參與細胞趨化轉(zhuǎn)移、細胞極化、凋亡和樹突發(fā)育等多項生命活動。我們前期研究表明ELMOs在乳腺癌細胞的趨化運動中發(fā)揮著重要作用，其中ELMO1通過與Dock180形成復(fù)合物，活化Rac1和Rac2從而影響腫瘤細胞的運動和侵襲。在本研究中，我們將EL

2、MO2與肝癌細胞趨化運動相關(guān)聯(lián)，分別應(yīng)用小RNA干擾技術(shù)和慢病毒技術(shù)降低及增強ELMO2的表達水平，從而進一步探討ELMO2不同表達水平對肝癌細胞運動的影響，初步明確ELMO2在肝癌細胞趨化運動和轉(zhuǎn)移中的重要作用，為尋找抑制肝癌轉(zhuǎn)移的新靶點奠定基礎(chǔ)。
　　 方法:
　　 1.采用合成ELMO2的RNAi序列，利用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染方法獲得瞬時轉(zhuǎn)染的肝癌細胞系，然后進行Western Blotting驗證，篩出降表達效果最明顯的序

3、列片段。
　　 2.利用篩選出降表達最有效序列合成降表達ELMO2的慢病毒質(zhì)粒，再將合成慢病毒質(zhì)粒通過脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染方法制備慢病毒。
　　 3.利用生物信息學(xué)方法獲得ELMO2基因序列，合成引物制備ELMO2過表達慢病毒質(zhì)粒，利用同樣方法獲得過表達ELMO2慢病毒。
　　 4.利用制備的降表達ELMO2及過表達ELMO2慢病毒感染肝癌細胞系HepG2，經(jīng)過藥物篩選獲得穩(wěn)轉(zhuǎn)細胞系。
　　 5.經(jīng)Western

4、Blotting驗證成功過表達ELMO2及降表達ELMO2的HepG2細胞系進行相關(guān)細胞功能學(xué)實驗，例如趨化、劃痕和侵襲以便驗證對其趨化及遷移能力的影響。
　　 結(jié)果:
　　 1.利用合成的3個ELMO2的RNAi序列，分別轉(zhuǎn)染肝癌細胞系HepG2，經(jīng)Western Blotting驗證篩出ELMO2-1是最有效的降表達序列。
　　 2.利用篩出ELMO2最有效降表達序列構(gòu)建慢病毒質(zhì)粒，經(jīng)過測序驗證獲得成功，經(jīng)過

5、脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染方法包裝降表達ELMO2慢病毒。
　　 3.經(jīng)生物信息學(xué)方法獲得ELMO2基因序列，合成過表達ELMO2慢病毒質(zhì)粒獲得成功，同樣方法包裝得到過表達ELMO2慢病毒。
　　 4.利用成功制各的慢病毒感染肝癌細胞系HepG2，經(jīng)過藥物篩選獲得過表達ELMO2和降表達ELMO2的穩(wěn)轉(zhuǎn)HepG2細胞系。
　　 5.通過慢病毒感染獲得過表達ELMO2和降表達ELMO2的肝癌細胞系，同正常肝癌細胞HepG2對照組相

6、比較ELMO2蛋白表達水平明顯升高和降低。
　　 6.同對照組相比較，在劃痕實驗中，過表達ELMO2的HepG2肝癌細胞運動能力增強，而降表達ELMO2的HepG2細胞系運動能力明顯降低。
　　 7.與對照組相比較，在趨化實驗中，過表達ELMO2的細胞能夠明顯增強CXCL12誘導(dǎo)的肝癌細胞的趨化運動能力，而降表達ELMO2的HepG2細胞系趨化能力明顯降低。
　　 8.在之后的侵襲實驗中，與對照組相比較，過表達E