ANG通過HMGA2調(diào)控肺鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞遷移、侵襲功能機(jī)制研究.pdf

1、目的:作為一種惡性腫瘤，肺癌在全球范圍內(nèi)的死亡率高居第一，雖然近年來針對(duì)其的診治方法已取得了長(zhǎng)足的進(jìn)展，但是其預(yù)后仍不甚理想。而降低肺癌細(xì)胞細(xì)胞的侵襲及轉(zhuǎn)移能力仍是降低肺癌發(fā)病率及致死率的重要一環(huán)。而肺鱗癌作為肺癌的第二大病理分型，占全部病理分型的40％。
　　血管生成素(ANG)作為血管核糖核酸酶RNase A家族的一員，在多種腫瘤細(xì)胞中高表達(dá)，它具有33％的氨基酸成分及56％的RNase-A同源性。ANG被認(rèn)為在腫瘤血管生成的

2、過程中起著關(guān)鍵的作用。而近些年的研究發(fā)現(xiàn)，ANG可以直接刺激rRNA的轉(zhuǎn)錄從而促進(jìn)細(xì)胞的增殖，并與腫瘤的預(yù)后不良具有一定的相關(guān)性。ANG還可以裂解tRNA來影響腫瘤細(xì)胞中的各種反應(yīng)，包括細(xì)胞的增殖、浸潤(rùn)以及細(xì)胞核中管道的形成等，而在正常的非內(nèi)皮細(xì)胞的細(xì)胞核中，ANG卻鮮有表達(dá)。
　　高遷移率族蛋白-2(HMGA2)被報(bào)道參與了多種生物學(xué)發(fā)展過程，包括胚胎的形成及腫瘤的發(fā)展。因?yàn)樗梢酝ㄟ^改變?nèi)旧|(zhì)的結(jié)構(gòu)來調(diào)節(jié)多種靶基因的表達(dá)，HM

3、GA2常被稱為是”建筑轉(zhuǎn)錄因子”。他被報(bào)道與多種惡性腫瘤的不良預(yù)后具有相關(guān)性。
　　基于此，本研究擬探究ANG-HMGA2通路對(duì)肺鱗癌細(xì)胞增殖、遷移及侵襲能力的影響，并探討其可能的作用機(jī)制。并為今后ANG介導(dǎo)的相關(guān)靶向治療提供科學(xué)的依據(jù)。
　　方法:本研究分為以下三個(gè)部分:
　　1、檢測(cè)肺鱗癌組織和正常癌旁組織中ANG和HMGA的表達(dá):收集肺鱗癌患者的腫瘤病灶組織與患者癌旁正常的肺組織，利用RT-PCR、Western

4、 Blot及免疫組織化學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)在mRNA及蛋白水平檢測(cè)ANG及HMGA2在正常肺組織與肺鱗癌組織中的表達(dá)有無差異，利用免疫組織化學(xué)染色實(shí)驗(yàn)對(duì)比正常癌旁肺組織標(biāo)本和肺鱗癌腫瘤組織標(biāo)本中ANG及HMGA2表達(dá)情況。
　　2、ANG及HMGA2在肺鱗癌細(xì)胞中表達(dá)的關(guān)聯(lián)性及對(duì)肺鱗癌細(xì)胞功能的影響:培養(yǎng)人肺鱗癌細(xì)胞株SK-MES-1，并構(gòu)建包有ANG及干擾ANG的RNA腺病毒。用Ad-ANG及ShHMGA2轉(zhuǎn)染細(xì)胞株SK-MES-1，以A

5、d-GFP及shScramble作為轉(zhuǎn)染對(duì)照，采用RT-PCR及Western Blot技術(shù)分別對(duì)比過表達(dá)及沉默ANG后HMGA2的表達(dá)差異。對(duì)比過表達(dá)及沉默HMGA2后SK-MES-1的增殖、遷移及侵襲等功能學(xué)改變。
　　3、ANG直接調(diào)控HMGA2表達(dá)的機(jī)制研究:培養(yǎng)培養(yǎng)人肺鱗癌細(xì)胞株 SK-MES-1，構(gòu)建Ad-ANG及shHMGA2，轉(zhuǎn)染SK-MES-1，以同種細(xì)胞株轉(zhuǎn)染Ad-GFP及shScramble作對(duì)照，驗(yàn)證過表達(dá)

6、ANG但沉默HMGA2后兩組細(xì)胞間遷移、侵襲及增殖等功能的差異。然后采用染色體免疫共沉淀方法(CHIP)技術(shù)驗(yàn)證HMGA2是否結(jié)合在ANG啟動(dòng)子區(qū)。
　　結(jié)果:1、通過qPCR在12對(duì)肺鱗癌及癌旁組織對(duì)ANG和HMGA2進(jìn)行mRNA層面的檢測(cè)，我們得出肺鱗癌組織中的ANG及HMGA2的mRNA表達(dá)相對(duì)于對(duì)照組明顯升高(P＜0.05)，同樣的趨勢(shì)也出現(xiàn)在Western Blot及免疫組化中。2、在細(xì)胞層面上，我們對(duì)肺鱗癌細(xì)胞系SK-

7、MES-1轉(zhuǎn)染了包有ANG的腺病毒，分別在mRNA水平及Western Blot水平驗(yàn)證轉(zhuǎn)染效率后，隨后利用RT-PCR檢測(cè)實(shí)驗(yàn)和對(duì)照組的ANG及HMGA2的mRNA的量，結(jié)果示，實(shí)驗(yàn)組HMGA2mRNA表達(dá)水平高于對(duì)照組(P＜0.05)。而肺鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞系SK-MES-1中轉(zhuǎn)染Ad-ANG后行Transwell遷移及侵襲試驗(yàn)后遷移及侵襲細(xì)胞數(shù)經(jīng)高倍顯微鏡計(jì)數(shù)后與對(duì)照組相比具有顯著增多（*P＜0.05）。而轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞系在CCK8增殖

8、實(shí)驗(yàn)在450nm處的OD值與對(duì)照組相比其具有顯著差異（*P＜0.05）。3、在共轉(zhuǎn)染Ad-ANG及shHMGA2后，經(jīng)PCR和Western Blot實(shí)驗(yàn)檢測(cè)，HMGA2在mRNA和蛋白層面的表達(dá)相對(duì)于對(duì)照組差異明顯。Transwell遷移及侵襲試驗(yàn)結(jié)果示在HMGA2干擾組中，高倍鏡下觀察，透膜遷移及侵襲的細(xì)胞明顯減少。CCK8細(xì)胞增殖試驗(yàn)示HMGA2干擾組的細(xì)胞相對(duì)于對(duì)照組在OD450的吸光值明顯降低。接下來，染色體免疫共沉淀結(jié)果示A

9、NG確實(shí)與HMGA2啟動(dòng)子序列有結(jié)合。
　　結(jié)論:ANG及其潛在下游調(diào)控蛋白HMGA2在肺鱗狀細(xì)胞癌組織中高表達(dá)，過表達(dá)了ANG后，HMGA2在mRNA層面及蛋白層面均顯著提高，且細(xì)胞的增殖、遷移及侵襲能力均有顯著提高。同樣過表達(dá)ANG，HMGA2抑制組細(xì)胞的增殖、遷移及增殖功能明顯降低，這進(jìn)一步證實(shí)了ANG與HMGA2在肺鱗癌細(xì)胞中的關(guān)聯(lián)。最后，我們用染色體免疫共沉淀的實(shí)驗(yàn)方法證實(shí)ANG是結(jié)合于HMGA2啟動(dòng)子序列，表明ANG對(duì)