IL-7-IL-7R調(diào)控非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞遷移侵襲和凋亡的機(jī)制研究.pdf

1、前言：
　　肺癌已經(jīng)成為全世界癌癥導(dǎo)致死亡的主要原因之一，約有85％的肺癌被確診為非小細(xì)胞肺癌，肺癌轉(zhuǎn)移是導(dǎo)致患者死亡的主要原因。因此，研究肺癌轉(zhuǎn)移的分子機(jī)制，挖掘有效的生物標(biāo)記物，探索新的治療靶點是非常必要的。IL-7是個分子量約為25KD的單鏈糖蛋白，人類的IL-7R基因位于染色體5q13。IL-7/IL-7R信號通路不僅在正常免疫系統(tǒng)發(fā)育和維持正常的免疫功能中發(fā)揮重要作用，在一些自身免疫疾病中也發(fā)揮重要作用。近年的研究表明，

2、IL-7/IL-7R信號通路參與許多惡性腫瘤包括淋巴瘤和多種類型白血病的發(fā)病及其進(jìn)展過程。一些人類的腫瘤細(xì)胞能夠產(chǎn)生IL-7，IL-7R在乳腺癌、結(jié)腸癌、腎癌和中樞神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤細(xì)胞表面高表達(dá)，提示IL-7/IL-7R在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮著重要作用。然而IL-7及IL-7R是否能調(diào)節(jié)肺癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移和凋亡，又是通過何種機(jī)制影響肺癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移和凋亡，這些研究未見報道。為了明確這些問題，我們檢測了非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞中IL-7及IL-7R對肺癌細(xì)胞遷

3、移、侵襲和凋亡的影響，研究了IL-7及IL-7R調(diào)節(jié)肺癌細(xì)胞遷移、侵襲和凋亡的作用機(jī)制，并檢測了遷移、侵襲和凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)情況和下游信號通路相關(guān)的信號分子。
　　材料與方法：
　　1、細(xì)胞培養(yǎng)
　　凍存于液氮的A549、H1299、H460和HBE等細(xì)胞經(jīng)復(fù)蘇后細(xì)胞使用RPMI1640和高糖DMEM培養(yǎng)基含10％的滅活小牛血清，以及100IU/ml青霉素和100μg/ml鏈霉素。37℃、5％CO2的條件下培養(yǎng)，每兩

4、天換一次液，并用0.25％的胰酶進(jìn)行傳代。
　　2、干擾siRNA轉(zhuǎn)染
　　轉(zhuǎn)染前24小時將細(xì)胞按50％密度接種于6孔板，分別轉(zhuǎn)染siRNA對照，IL-7RsiRNA和p53siRNA，8-12hFCM監(jiān)測轉(zhuǎn)染效率，48h后終止細(xì)胞培養(yǎng)，用于后續(xù)實驗。Real-time PCR和Western blot檢測干擾效率。IL-7R和p53干擾序列和陰性對照均購自上海吉瑪公司。
　　3、Real-time PCR和Weste

5、rn blot
　　轉(zhuǎn)染IL-7R的siRNA和對照siRNA的細(xì)胞收集后Real time PCR和Western blot分別檢測了干擾效率，達(dá)到干擾效率的同時Real-time PCR和Western blot檢測了下游信號相關(guān)蛋白的表達(dá)。
　　4、流式表面分子檢測
　　將接種在6孔板不同處理組的每孔細(xì)胞收集后分別加入PBS、FITC-IL-7R抗體和FITC-IgG1冰上避光孵育30min。PBS清洗2次后，4

6、℃，1500rpm離心5min。最終加入300uLPBS上機(jī)流式細(xì)胞儀檢測。結(jié)果用FlowJo7.6.1軟件分析。
　　5、Transwell細(xì)胞侵襲和遷移實驗
　　在具有8μm小孔聚碳酸酯濾膜的培養(yǎng)小室上鋪用預(yù)冷無血清培養(yǎng)基1∶3稀釋的Matrigel基質(zhì)膠，放入培養(yǎng)箱凝固4小時。接種100μl含4×104個/mL細(xì)胞，下室加入600μl1640培養(yǎng)液，每組設(shè)6復(fù)孔。培養(yǎng)22-24h后，用棉棒輕輕拭去小室上表面的基質(zhì)膠。清

7、洗，甲醛固定，蘇木精中染核，清洗晾干。光學(xué)顯微鏡下觀察、照相，并計數(shù)每高倍視野濾膜底面的平均細(xì)胞數(shù)。遷移實驗不需鋪膠，直接接種細(xì)胞。其余步驟同上。
　　6、劃痕實驗
　　在每孔中接種細(xì)胞，待細(xì)胞長滿無空隙時，用絲裂霉素處理2h。用PBS清洗細(xì)胞3次，用黃槍頭比照已畫好的橫線劃痕，劃好后，用PBS清洗細(xì)胞3次，以便去除劃下的細(xì)胞。按照事先分組，加入不同處理因素，37℃、5％CO2的條件下培養(yǎng)。按0，6，12，24小時取出拍照。

8、每組實驗重復(fù)孔至少3個，取劃痕寬度平均值。
　　7、MMP9活性檢測
　　細(xì)胞在無血清的培養(yǎng)基中培養(yǎng)24h。次日收集上清，配置含1％明膠的SDS-PAGE凝膠。上樣，電泳，電泳結(jié)束后，將凝膠取出先洗脫后孵育，孵育結(jié)束后染色。染色結(jié)束，放入脫色液中進(jìn)行震蕩脫色。將凝膠放在成像分析儀中采集圖像，以備分析。
　　8、細(xì)胞凋亡實驗
　　將大約50％密度的A549、H1299和HBE細(xì)胞鋪到六孔板中，轉(zhuǎn)染IL-7R和p53

9、干擾序列和對照序列，48小時后收集細(xì)胞，按Annexin V-FITC Apoptosis Kit(BD Pharmingen，USA)步驟進(jìn)行，然后用BD儀器進(jìn)行檢測。
　　9、統(tǒng)計學(xué)分析
　　采用SPSS16.0統(tǒng)計分析軟件，用單因素方差分析評價各種處理組間的不同，隨后的亞組分析用LSD檢驗或Dunnett T3檢驗;數(shù)據(jù)以三次獨立實驗的均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，*P＜0.05和**P＜0.01為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。
　　結(jié)

10、果：
　　1、IL-7/IL-7R通過JAK1-PI3K/AKT信號途徑上調(diào)RhoAmRNA和蛋白表達(dá)激活RhoA/ROCK/MLC通路促進(jìn)肺癌細(xì)胞遷移，通過JAK1-PI3K/AKT信號途徑下調(diào)TIMP1mRNA和蛋白表達(dá)增加MMP9活性促進(jìn)肺癌細(xì)胞侵襲。
　　2、IL-7/IL-7R信號途徑可以通過p53途徑調(diào)控bcl-2和bax表達(dá)抑制非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞凋亡。
　　結(jié)論：
　　1.IL-7/IL-7R通過JA