PRRX1下調(diào)對(duì)非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞增殖和凋亡的作用及機(jī)制的研究.pdf

1、第一部分：PRRX1在非小細(xì)胞肺癌中的組織學(xué)表達(dá)特征及臨床意義
　　目的：通過(guò)檢測(cè)PRRX1在非小細(xì)胞肺癌患者中的表達(dá)情況，結(jié)合患者臨床資料，了解PRRX1在肺癌中臨床價(jià)值。
　　方法：利用免疫組化法檢測(cè)52例非小細(xì)胞肺癌組織標(biāo)本和28例癌旁正常肺組織標(biāo)本中PRRX1表達(dá)情況，結(jié)合患者的臨床病理資料和預(yù)后情況，應(yīng)用Kaplan-Meier生存分析法和COX比例風(fēng)險(xiǎn)回歸模型分析PRRX1與患者預(yù)后的關(guān)系。
　　結(jié)果：1.

2、免疫組化結(jié)果顯示PRRX1在癌旁正常肺組織中呈現(xiàn)穩(wěn)定中度表達(dá)；在非小細(xì)胞肺癌組織中PRRX1高度表達(dá)存在高分化的肺癌組織中，PRRX1中低表達(dá)存在中度分化的肺癌組織中，PRRX1低表達(dá)或者表達(dá)缺失存在于低分化的肺癌組織中。2.低表達(dá)PRRX1與患者的腫瘤大小分期，疾病分期和腫瘤分化程度相關(guān)（P=0.002, P=0.019和 P=0.001）。3. COX比例風(fēng)險(xiǎn)回歸模型多因素分析顯示淋巴結(jié)分期、疾病分期和PRRX1表達(dá)水平是患者預(yù)后的

3、獨(dú)立因素(Cox回歸分析：P=0.048, P=0.008和P=0.035)。4.PRRX1低表達(dá)患者生存周期較高表達(dá)者縮短（log-rank檢驗(yàn)，P=0.010）。
　　結(jié)論：PRRX1的表達(dá)情況與非小細(xì)胞肺癌患者的疾病分期、細(xì)胞分化、預(yù)后相關(guān)。低表達(dá)的PRRX1提示患者預(yù)后差。
　　第二部分：沉默PRRX1誘導(dǎo)A549細(xì)胞經(jīng)歷EMT和獲得CSCs特性
　　目的：構(gòu)建PRRX1基因沉默的PRRX1-shRNA-A54

4、9細(xì)胞模型，進(jìn)一步研究在A549細(xì)胞中沉默PRRX1與EMT和CSCs特性的關(guān)系。
　　方法：通過(guò)shRNA技術(shù)沉默A549細(xì)胞中PRRX1表達(dá)，構(gòu)建PRRX1-shRNA-A549細(xì)胞模型。Western blot實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證模型構(gòu)建情況，應(yīng)用MTT和軟瓊脂克隆生長(zhǎng)實(shí)驗(yàn)觀察模型細(xì)胞的增殖能力，相差顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化。Transwell體外侵襲、入侵實(shí)驗(yàn)和創(chuàng)傷愈合實(shí)驗(yàn)檢測(cè)模型細(xì)胞的侵襲和移動(dòng)能力。Western blot實(shí)驗(yàn)和免

5、疫熒光實(shí)驗(yàn)觀察模型細(xì)胞的上皮和間質(zhì)標(biāo)志物表達(dá)情況。流式細(xì)胞儀分選模型細(xì)胞上肺癌CSCs標(biāo)志物比例。
　　結(jié)果：1. Western blot檢測(cè)結(jié)果顯示A549細(xì)胞中PRRX1為高表達(dá)，可以應(yīng)用基因沉默技術(shù)構(gòu)建細(xì)胞模型。2.成功構(gòu)建PRRX1-shRNA-A549、Mock-shRNA-A549細(xì)胞模型，Western blot實(shí)驗(yàn)顯示PRRX1表達(dá)明顯抑制在基因沉默細(xì)胞模型中。3.MTT和軟瓊脂克隆生長(zhǎng)實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，沉默PRRX

6、1后，細(xì)胞貼壁和非貼壁增殖情況明顯受到增強(qiáng)。4.相差顯微鏡下可見(jiàn)，沉默PRRX1后，A549細(xì)胞形態(tài)向間質(zhì)細(xì)胞表型特征轉(zhuǎn)化。5. Transwell體外侵襲、入侵實(shí)驗(yàn)和創(chuàng)傷愈合實(shí)驗(yàn)顯示，沉默PRRX1后，細(xì)胞的移動(dòng)和侵襲能力增強(qiáng)。6.沉默PRRX1后，A549細(xì)胞的間質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志物Vimentin和N-cadherin表達(dá)上調(diào)，上皮細(xì)胞標(biāo)志物E-cadherin下調(diào)，并且免疫熒光實(shí)驗(yàn)結(jié)果得到相一致的結(jié)果。7.流式細(xì)胞儀檢測(cè)結(jié)果，細(xì)胞沉默P

7、RRX1后，肺癌干細(xì)胞標(biāo)準(zhǔn)物（CD133、CD44、ALDH1）細(xì)胞比例提高，分別為77.6%、4.1%、1.5%。
　　結(jié)論：敲除PRRX1誘導(dǎo)肺腺癌細(xì)胞經(jīng)歷EMT，獲得CSCs特性，增強(qiáng)了細(xì)胞增殖、侵襲的能力。
　　第三部分：沉默PRRX1通過(guò)干擾caspase-3凋亡通道激活抑制順鉑誘導(dǎo)的A549細(xì)胞凋亡
　　目的：通過(guò)已經(jīng)建立的PRRX1-shRNA-A549細(xì)胞模型，觀察PRRX1沉默后，順鉑誘導(dǎo)的A549細(xì)

8、胞凋亡和凋亡通道的變化，探討PRRX1在順鉑誘導(dǎo)A549細(xì)胞凋亡中的作用機(jī)制。
　　方法：通過(guò)MTT實(shí)驗(yàn)檢測(cè)PRRX1沉默后順鉑對(duì)于細(xì)胞增殖抑制情況，并選擇最佳順鉑實(shí)驗(yàn)濃度。流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞周期和細(xì)胞凋亡情況。線(xiàn)粒體膜電位檢測(cè)線(xiàn)粒體體外膜電位的變化情況。Western blot實(shí)驗(yàn)檢測(cè)凋亡相關(guān)蛋白（caspase-3, caspase-9, cytochrome C和 Apaf-1）的表達(dá)情況，判斷PRRX1沉默后細(xì)胞凋亡通道。

9、MTT實(shí)驗(yàn)和細(xì)胞凋亡實(shí)驗(yàn)中添加caspase-3激活劑PAC-1，反向驗(yàn)證PRRX1沉默干擾的細(xì)胞凋亡通道。
　　結(jié)果：1. MTT實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，PRRX1沉默后阻止了順鉑誘導(dǎo)的A549細(xì)胞增殖抑制，順鉑濃度為20μg/ml是后續(xù)實(shí)驗(yàn)最佳濃度。2.流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，PRRX1沉默后，細(xì)胞凋亡明顯受到抑制。3.流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞周期實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，PRRX1沉默后，細(xì)胞周期阻滯在G2期。4.線(xiàn)粒體膜電位檢測(cè)結(jié)果顯示，