CHAF1A基因在非小細胞肺癌細胞中的功能和分子機制研究.pdf

1、研究目的：
　　1.檢測CHAF1A在非小細胞肺癌（NSCLC）組織及癌旁組織中的表達情況，闡明CHAF1A在非小細胞肺癌中的表達；并研究CHAF1A與部分臨床參數(shù)的關(guān)系；
　　2.檢測CHAF1A基因在人肺癌細胞株A549、H1299和H1975中的表達；應用siRNA干擾技術(shù)進行慢病毒包裝并感染目的細胞，敲減CHAF1A基因，干擾CHAF1A基因表達，觀察細胞的生長、增殖及凋亡；
　　3.探討CHAF1A基因敲減后

2、非小細胞肺癌細胞周期的變化；
　　4.檢測敲減CHAF1A基因后，非小細胞肺癌細胞下游靶基因表達的變化。探尋具有非小細胞肺癌生長、增殖、轉(zhuǎn)移潛能的預測性生物標志物及其作用機制，為肺癌的診治探索新的思路。
　　研究方法：
　　1.收集2010年12月至2016年1月在山西醫(yī)科大學第二附屬醫(yī)院胸外科行手術(shù)切除，并且全部經(jīng)過病理診斷證實為非小細胞肺癌（NSCLC）的患者218例，行免疫組化、免熒光PCR檢測，闡明CHAF1A

3、在非小細胞肺癌中的表達；分析CHAF1A與部分臨床參數(shù)的關(guān)系；
　　2.將包裝含有CHAF1A基因RNA干擾靶點序列及空載對照慢病毒分別感染H1299細胞，采用倒置顯微鏡觀察綠色熒光蛋白表達情況，觀察病毒感染率；Realtime PCR法檢測肺癌細胞系H1299細胞CHAF1A的表達變化；
　　3.MTT法、Cellomics細胞計數(shù)及細胞克隆形成試驗，檢測敲減CHAF1A基因后，肺癌H1299細胞的增殖；
　　4.C

4、HAF1A基因敲減后，采用流式細胞技術(shù)檢測非小細胞肺癌H1299細胞周期的變化及細胞凋亡；
　　5.Western blot技術(shù)檢測CHAF1A基因敲減后非小細胞肺癌H1299細胞下游靶基因p21、p27、細胞周期蛋白依賴性激酶2（CDK2）、Skp2、cyclin D1等的表達水平。
　　研究結(jié)果：
　　1.免疫組化結(jié)果顯示:CHAF1A主要在非小細胞肺癌細胞胞漿和細胞膜中表達，與正常肺組織相比，CHAF1A在非小細

5、胞肺癌組織中表達明顯上調(diào)；CHAF1A的表達量與非小細胞肺癌患者性別、年齡的關(guān)系無統(tǒng)計學意義，而與吸煙與否、腫瘤大小、及腫瘤轉(zhuǎn)移相關(guān)；CHAF1A基因在A549、H1299和H1975細胞中mRNA的ΔCt值均小于9.6，表達豐度高；
　　2.定量PCR結(jié)果顯示:siRNA慢病毒感染后，H1299細胞中CHAF1A基因在mRNA水平的表達量受到抑制（p<0.05），敲減效率達到84.7％；
　　3.Cellomics計數(shù)表明

6、:CHAF1A基因敲減后細胞數(shù)量明顯降低(162±10 vs.523±8 cells/field,P<0.05)；克隆形成實驗顯示:CHAF1A基因敲減后H1299細胞形成的克隆數(shù)顯著低于對照組（21±9 vs.84±12 colonies/dish,P<0.05；MTT檢測結(jié)果顯示:與對照組相比CHAF1A基因敲減后細胞增殖、生長能力明顯下降（P<0.05）；相比對照組CHAF1A基因敲減后H1299細胞凋亡數(shù)增多（P<0.05）；<

7、br>　　4.與對照組相比CHAF1A基因敲減后H1299處于G1期的細胞減少(P<0.05)，處于S期的細胞增多(P<0.05)，處于G2/M期的細胞顯著減少(P<0.05)。表明CHAF1A基因敲減后H1299出現(xiàn)了S期向G2/M期的轉(zhuǎn)化減少，細胞阻滯于S期；
　　5.Western blot分析了解CHAF1A基因敲減后下游基因蛋白的變化，結(jié)果顯示:H1299細胞CHAF1A基因敲減后cyclin D1、CDK2、Skp2表

8、達下調(diào)，p21和p27的表達上調(diào)。
　　結(jié)論：
　　1.和正常組織相比:CHAF1A mRNA、蛋白在非小細胞肺癌組織中表達上調(diào)；肺癌細胞株A549、H1299和H1975中CHAF1A基因表達明顯。
　　2.CHAF1A過度表達與非小細胞肺癌患者臨床病理密切相關(guān)，CHAF1A可能是非小細胞肺癌預后的一個重要指標。
　　3.本研究采用siRNA干擾技術(shù)，進行慢病毒包裝并感染目的細胞，沉默CHAF1A基因，降低H1

9、299細胞mRNA的表達；成功建立了穩(wěn)定的CHAF1A-siRNA細胞株。
　　4.在非小細胞肺癌H1299，敲減CHAF1A基因使細胞增殖受抑制，克隆形成顯著減少；且H1299細胞凋亡明顯增加。
　　5.CHAF1A基因敲減后H1299細胞S期向G2/M期的轉(zhuǎn)化減少，細胞阻滯于S期。
　　6.敲減H1299細胞CHAF1A基因后，cyclin D1、CDK2、Skp2表達下調(diào)，p21和p27的表達上調(diào)，抑制DNA的合