Bin1在非小細(xì)胞肺癌中的功能及其機制研究.pdf

1、第一部分：
　　目的：檢測橋接整合因子-1（bridging integrator-1, Bin1）在H1975、H1650、A549、H460四種人非小細(xì)胞肺癌（non-small cell lung cancer， NSCLC）細(xì)胞和正常人胚肺成纖維細(xì)胞2BS細(xì)胞中的表達(dá)情況，篩選出Bin1低表達(dá)的非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞；構(gòu)建Bin1穩(wěn)定過表達(dá)的慢病毒載體質(zhì)粒，研究Bin1過表達(dá)對NSCLC細(xì)胞系H1975細(xì)胞的增殖、遷移及侵襲能力

2、的影響。
　　方法：
　　1.采用實時熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（quantificational real-time polymerase chainreaction, qRT-PCR）方法和Western blot實驗檢測Bin1在H1975、H1650、A549、H460四種人非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞和人胚肺成纖維細(xì)胞2BS細(xì)胞中的表達(dá)情況，篩選出Bin1低表達(dá)的非小細(xì)胞肺癌H1975細(xì)胞。
　　2.構(gòu)建攜帶Bin1基因的慢

3、病毒載體pCDH-Bin1，體外以病毒轉(zhuǎn)染的方式將Bin1基因轉(zhuǎn)入H1975細(xì)胞（Bin1+組），并分別設(shè)置空載體組（pCDH組）和空白對照組（Con組），流式細(xì)胞術(shù)分別篩選出穩(wěn)定表達(dá)Bin1和空載體的H1975細(xì)胞，擴(kuò)大培養(yǎng)后，經(jīng)qRT-PCR和Western blot方法鑒定，獲得穩(wěn)定過表達(dá)Bin1的H1975細(xì)胞系。
　　3.利用MTT實驗和平板克隆形成實驗檢測Bin1對H1975細(xì)胞增殖能力的影響。
　　4.流式細(xì)胞

4、術(shù)檢測Bin1對H1975細(xì)胞細(xì)胞周期的影響。
　　5.細(xì)胞劃痕實驗和Transwell侵襲實驗檢測Bin1對H1975細(xì)胞遷移和侵襲能力的影響。
　　結(jié)果：
　　1.qRT-PCR和Western blot實驗結(jié)果表明，與人胚肺成纖維細(xì)胞2BS細(xì)胞相比，H1975、H1650、A549中Bin1基因和蛋白的表達(dá)水平明顯低于2BS細(xì)胞中Bin1基因和蛋白的表達(dá)水平，其中H1975細(xì)胞中Bin1基因和蛋白表達(dá)量最低（P<

5、0.05），而H460中Bin1基因和蛋白表達(dá)量與2BS細(xì)胞相比差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）。篩選出Bin1表達(dá)量最低的H1975細(xì)胞，用于后續(xù)實驗。
　　2.qRT-PCR和Western blot實驗結(jié)果表明，與pCDH組和Con組相比， Bin1+組H1975細(xì)胞中Bin1基因和蛋白表達(dá)水平顯著升高（P<0.05），pCDH組和 Con組相比， Bin1基因和蛋白的表達(dá)水平差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05），說明Bin1已

6、成功轉(zhuǎn)入H1975細(xì)胞中。以流式細(xì)胞術(shù)篩選的方式獲得穩(wěn)定過表達(dá)Bin1的Bin1+細(xì)胞和穩(wěn)定表達(dá)pCDH載體的pCDH組細(xì)胞。
　　3.MTT實驗結(jié)果表明，在H1975細(xì)胞中，Bin1+組細(xì)胞在24h、48h、72h、96h、120h增殖率分別為0.0543±0.021，0.1249±0.034，0.2348±0.027，0.3594±0.019，0.4923±0.031；pCDH組細(xì)胞在24h、48h、72h、96h、120h增

7、殖率分別為0.0634±0.024，0.3549±0.037，0.4988±0.047，0.9857±0.019，1.524±0.053；Con組細(xì)胞在24h、48h、72h、96h、120h增殖率分別為0.0619±0.029，0.3624±0.042，0.4874±0.039，0.9957±0.023，1.5097±0.046。與pCDH組和Con組相比，Bin1在48h、72h、96h、120h可以抑制H1975細(xì)胞的增殖活性（P

8、<0.05），而pCDH組和Con組細(xì)胞的增殖活性相比差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05），說明Bin1可以抑制H1975細(xì)胞的增殖活性。平板克隆形成實驗結(jié)果表明，相同條件培養(yǎng)7天后，Bin1+組細(xì)胞克隆形成能力為pCDH組的59％（P<0.05），為Con組的61%（P<0.05），而pCDH組和Con組細(xì)胞的克隆形成能力相比差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）。說明Bin1可以抑制H1975細(xì)胞的克隆形成能力。以上實驗結(jié)果表明Bin1可以抑

9、制H1975細(xì)胞的增殖能力。
　　4.細(xì)胞周期實驗結(jié)果表明，Bin1+組細(xì)胞G0/G1期比例為（67.12±1.74）%，pCDH組細(xì)胞G0/G1期比例為（55.81±1.48）%，Con組細(xì)胞G0/G1期比例為（56.41±2.03）%，與pCDH組和Con組相比，Bin1+組細(xì)胞G0/G1期比例顯著增加（P<0.05），而pCDH組和Con組相比G0/G1期比例差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05），說明Bin1+組細(xì)胞中DNA合成

10、受限，阻止細(xì)胞從G0/G1期進(jìn)入S期，進(jìn)而誘導(dǎo)H1975細(xì)胞發(fā)生細(xì)胞周期阻滯。
　　5.細(xì)胞劃痕實驗結(jié)果顯示，Bin1+組細(xì)胞12h遷移距離為（25.3±2.6）μm，pCDH組細(xì)胞12h遷移距離為（58±5.2）μm，Con組細(xì)胞12h遷移距離為（60.21±4.2）μm；Bin1+組24h遷移距離為（58.7±3.8）μm，pCDH組24h遷移距離為（92.3±4.3）μm，Con組24h遷移距離為（89.7±5.8）μm。與

11、pCDH組和Con組相比，Bin1+組遷移變化在12h及24h后均有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05），且細(xì)胞遷移距離明顯縮短（P>0.05）；而pCDH組和Con組相比，劃痕12h及24h后細(xì)胞遷移變化均無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05），說明Bin1能夠抑制H1975細(xì)胞的遷移能力。Transwell實驗顯示，Bin1+組、pCDH組、Con組穿膜細(xì)胞數(shù)分別為50.50±3.15、124.00±4.25、130±4.37，與pCDH組和Con組相

12、比，Bin1+組穿膜細(xì)胞數(shù)明顯降低(P<0.05)，而pCDH組和Con組相比，兩者差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，說明Bin1能夠降低H1975細(xì)胞的侵襲能力。
　　第二部分：
　　目的：檢測程序死亡因子受體（programmed death ligand1, PD-L1）在H1975、H1650、A549、H460四種人非小細(xì)胞肺癌（non-small cell lung cancer，NSCLC）細(xì)胞和人胚肺成纖維細(xì)

13、胞2BS細(xì)胞中的表達(dá)情況，通過過表達(dá)和RNA干擾兩種方式研究Bin1對免疫抑制因子PD-L1表達(dá)水平的影響，分析Bin1抑制NSCLC免疫逃逸的相關(guān)機制。
　　方法：
　　1.qRT-PCR和Western blot實驗檢測PD-L1在H1975、H1650、A549、H460四種人非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞和人胚肺成纖維細(xì)胞2BS細(xì)胞中的表達(dá)情況，并檢測Bin1對H1975細(xì)胞中PD-L1表達(dá)的影響。
　　2.構(gòu)建Bin1-s

14、iRNA，將其轉(zhuǎn)染入人H460細(xì)胞（Bin1-siRNA組）中，并設(shè)置空白對照組（Con組），通過qRT-PCR及Western blot實驗檢測RNA干擾效果，同時用qRT-PCR、Western blot方法檢測敲除Bin1對PD-L1表達(dá)水平的影響。
　　3.構(gòu)建c-MYC-siRNA，qRT-PCR和Western blot實驗檢測RNA干擾效果，并檢測敲除c-MYC對PD-L1表達(dá)水平的影響。
　　結(jié)果：
　

15、　1.qRT-PCR和Western blot實驗結(jié)果表明，與人胚肺成纖維細(xì)胞2BS細(xì)胞相比，H1975、H1650、A549細(xì)胞中PD-L1基因和蛋白的表達(dá)水平明顯高于2BS細(xì)胞中PD-L1基因和蛋白的表達(dá)水平，其中H1975細(xì)胞中PD-L1基因和蛋白表達(dá)量最高（P<0.05），而H460和A549細(xì)胞中PD-L1基因和蛋白表達(dá)量與2BS細(xì)胞相比差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）。結(jié)合第一部分第一個結(jié)果，篩選出Bin1表達(dá)量最低而PD-

16、L1表達(dá)量最高的H1975細(xì)胞，用于后續(xù)實驗；qRT-PCR和Western blot實驗結(jié)果表明，與pCDH組和Con組相比，Bin1+組細(xì)胞中PD-L1表達(dá)水平明顯下調(diào)（P<0.05），而pCDH組和Con組細(xì)胞中PD-L1表達(dá)水平差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，說明Bin1過表達(dá)可以抑制H1975細(xì)胞中PD-L1的表達(dá)水平。
　　2.qRT-PCR和Western blot實驗表明，與Con組相比，Bin1-siRNA組H

17、1975細(xì)胞中Bin1基因和蛋白表達(dá)水平顯著下降（P<0.05），說明H1975細(xì)胞中的Bin1已經(jīng)成功被敲低。與Con組相比，Bin1-siRNA組細(xì)胞中PD-L1水平明顯上調(diào)（P<0.05），說明Bin1可以負(fù)向調(diào)控PD-L1的表達(dá)。
　　3.qRT-PCR和Western blot結(jié)果顯示，與Con組相比，c-MYC-siRNA組H1975細(xì)胞中c-MYC基因和蛋白水平明顯下調(diào)（P<0.05），表明H1975細(xì)胞中的c-MY

18、C已經(jīng)成功被敲低；與Con組相比，c-MYC-siRNA組H1975細(xì)胞中PD-L1基因和蛋白水平明顯下降（P<0.05），說明Bin1可以通過失活c-MYC抑制PD-L1的表達(dá)進(jìn)而抑制NSCLC的免疫逃逸。
　　結(jié)論：
　　1.在人非小細(xì)胞肺癌H1975、H1650、A549、H460和人胚肺成纖維細(xì)胞2BS中，H1975細(xì)胞中的Bin1基因和蛋白表達(dá)水平最低；以慢病毒轉(zhuǎn)染的方法成功建立Bin1穩(wěn)定過表達(dá)的H1975細(xì)胞系

19、。
　　2.Bin1能夠抑制H1975細(xì)胞的增殖、遷移及侵襲能力。
　　3.在人非小細(xì)胞肺癌H1975、H1650、A549、H460和人胚肺成纖維細(xì)胞2BS中，H1975細(xì)胞中的PD-L1基因和蛋白表達(dá)水平最高；Bin1可以抑制H1975細(xì)胞中PD-L1的表達(dá)水平，敲低H1975細(xì)胞中c-MYC的表達(dá)水平可以顯著下調(diào)H1975細(xì)胞中PD-L1的表達(dá)水平，說明Bin1可以通過失活c-MYC途徑抑制非小細(xì)胞肺癌中PD-L1的表