MicroRNA-136在非小細(xì)胞肺癌中的作用及其相關(guān)機(jī)制研究.pdf

1、MicroRNAs(miRNAs)通過(guò)抑制靶基因的翻譯在腫瘤的發(fā)生和發(fā)展中發(fā)揮重要作用。研究已經(jīng)發(fā)現(xiàn)有多種miRNAs與非小細(xì)胞肺癌(non-small-celllungcancer，NSCLS)的發(fā)生有密切關(guān)系，但是miR-136在NSCLC中的作用目前還不清楚。我們?cè)诒狙芯恐邪l(fā)現(xiàn)，miR-136在NSCLC腫瘤組織中的表達(dá)顯著上調(diào)。通過(guò)對(duì)多種NSCLC細(xì)胞株進(jìn)行檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，與正常細(xì)胞株相比，NSCLC細(xì)胞株中miR-136的表達(dá)均有不

2、同程度的增加。抑制NSCLC細(xì)胞株A549中miR-136的表達(dá)能夠抑制該腫瘤細(xì)胞的錨定依賴性和非錨定依賴性增殖。同時(shí)，我們還發(fā)現(xiàn)miR-136促進(jìn)NSCLC細(xì)胞的增殖與胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶1/2（extracellular-signal-regulatedkinase1/2，Erk1/2）的活化有關(guān)。采用anti-miR-136抑制miR-136的表達(dá)后Erk1/2的磷酸化水平顯著降低。通過(guò)信息生物學(xué)方法結(jié)合熒光素酶報(bào)告基因分析的方法我們

3、發(fā)現(xiàn)，絲氨酸/蘇氨酸蛋白磷酸酶2A55Kda調(diào)節(jié)亞基Bα(serine/threonineproteinphosphatase2A55kDaregulatorysubunitBαisoform，PPP2R2A，B55α)是miR-136的一個(gè)直接靶基因，抑制miR-136的表達(dá)能夠顯著上調(diào)PPP2R2AmRNA和PPP2R2A蛋白的表達(dá)水平。在NSCLC細(xì)胞中過(guò)表達(dá)PPP2R2A后miR-136引起的ERK1/2活化受到抑制，同時(shí)miR

4、-136引起的細(xì)胞增殖也受到抑制。對(duì)NSCLC組織進(jìn)行免疫組化分析的結(jié)果也發(fā)現(xiàn)，PPP2R2A在NSCLC組織中的表達(dá)明顯低于正常的癌旁組織。說(shuō)明，miR-136是通過(guò)抑制PPP2R2A的表達(dá)促進(jìn)ERK1/2的磷酸化，總之，本研究發(fā)現(xiàn)在NSCLC中，miR-136通過(guò)抑制PPP2R2A促進(jìn)ERK1/2的活化，從而促進(jìn)細(xì)胞的增殖，提示其可能成為臨床NSCLC治療的一個(gè)有效靶點(diǎn)。
　　第一部分miR-136在NSCLC腫瘤組織及細(xì)胞株

5、中的表達(dá)
　　方法：
　　1.采用q-PCR的方法對(duì)37對(duì)NSCLC腫瘤組織，及其相應(yīng)的癌旁組織中miR-136的表達(dá)情況進(jìn)行分析。并采用q-PCR方法對(duì)NSCLC細(xì)胞系A(chǔ)549，SPC-A1，NCI-H1299和正常支氣管上皮細(xì)胞系16HBE中miR-136的表達(dá)進(jìn)行檢測(cè)
　　2.采用原位雜交的方法檢測(cè)了miR-136在NSCLC組織中的表達(dá)。
　　3.統(tǒng)計(jì)學(xué)處理:應(yīng)用SPSS13.0軟件處理數(shù)據(jù)，數(shù)據(jù)用均數(shù)±

6、標(biāo)準(zhǔn)差(x±s)，兩樣本均數(shù)比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn);兩個(gè)有序變量之間的相關(guān)性檢驗(yàn)用Spearman相關(guān)分析，兩分類(lèi)變量的比較用Pearson'sx2檢驗(yàn);以α=0.05為檢驗(yàn)水準(zhǔn)。P＜0.05時(shí)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　結(jié)果：
　　1.q-PCR和原位雜交的檢測(cè)結(jié)果均顯示，與相應(yīng)的正常組織相比，在NSCLC腫瘤組織中，miR-136的表達(dá)顯著增加。通過(guò)對(duì)患者臨床病理學(xué)特征進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)，miR-136的表達(dá)與患者的性別和年齡沒(méi)有明顯

7、的關(guān)系，但是，在腺癌中的表達(dá)要高于鱗狀細(xì)胞癌。另外，miR-136的表達(dá)水平與腫瘤是否發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移沒(méi)有明顯的關(guān)系，但是和腫瘤的分化程度呈負(fù)相關(guān)。
　　2.q-PCR的檢測(cè)結(jié)果顯示，與正常支氣管上皮細(xì)胞株16HBE相比，NSCLC細(xì)胞株A549，SPC-A1，NCI-H1650和NCI-H1299中miR-136的表達(dá)均有不同程度的上調(diào)，其中在A549中的表達(dá)增加最為顯著。
　　第二部分miR-136上調(diào)激活Erk1/2促進(jìn)

8、NSCLC細(xì)胞的增殖
　　方法：
　　1.采用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染的方法將miRNA抑制劑轉(zhuǎn)染至NSCLC細(xì)胞中，抑制miR-136的表達(dá)，并采用q-PCR的方法驗(yàn)證抑制效果。
　　2.采用MTT分析和軟瓊脂克隆形成實(shí)驗(yàn)檢測(cè)miR-136對(duì)NSCLC細(xì)胞的增殖能力的影響。
　　3.采用westernblot的方法檢測(cè)抑制NSCLC中的miR-136對(duì)Erk1/2信號(hào)通路的影響。
　　4.運(yùn)用免疫組織化學(xué)的方法檢測(cè)NS

9、CLC組織中Erk1/2信號(hào)通路的活化情況。
　　5.統(tǒng)計(jì)學(xué)處理:應(yīng)用SPSS13.0軟件處理數(shù)據(jù)，數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(x±s)，采用one-wayANOVA與student'st檢驗(yàn)各組間差異的顯著性，P＜0.05時(shí)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　結(jié)果：
　　1.與對(duì)照組相比，轉(zhuǎn)染了miR-136抑制劑anti-miR-136三天和五天之后，NSCLC細(xì)胞中miR-136的量分別下降了75％和64％(P＜0.05)。
　　

10、2.MTT分析實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示:抑制NSCLC細(xì)胞A549中miR-136的表達(dá)量之后，細(xì)胞的增殖能力顯著下降，與對(duì)照組相比，轉(zhuǎn)染了anti-miR-136之后第5天細(xì)胞的存活率下降至71％(P＜0.05)。
　　3.軟瓊脂克隆形成實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示:抑制A549細(xì)胞中miR-136的表達(dá)之后，細(xì)胞的克隆形成能力顯著下降。與對(duì)照組相比，轉(zhuǎn)染了anti-miR-136的細(xì)胞形成的克隆數(shù)減少了62％(P＜0.05)。
　　4.wester

11、nblot檢測(cè)結(jié)果顯示:抑制A549細(xì)胞中miR-136的表達(dá)使Erk1/2以劑量依賴的方式降低活性。轉(zhuǎn)染40nM的anti-miR-13672小時(shí)后，90％的Erk1/2磷酸化受到抑制。
　　5.免疫組織化學(xué)檢測(cè)結(jié)果顯示:在NSCLC組織中，Erk1/2的磷酸化上調(diào)與miR-136的表達(dá)上調(diào)相一致。與相應(yīng)的癌旁正常組織相比，NSCLC組織中Erk1/2的磷酸化水平明顯增高。
　　第三部分miR-136激活Erk1/2促進(jìn)N

12、SCLC細(xì)胞增殖的機(jī)制研究
　　方法：
　　1.利用PicTar和TargetScan軟件進(jìn)行分析預(yù)測(cè)miR-136的靶基因，并用熒光素酶報(bào)告基因分析的方法進(jìn)行驗(yàn)證。
　　2.采用轉(zhuǎn)染結(jié)合q-PCR或Westernblot的分別檢測(cè)miR-136對(duì)A549細(xì)胞中PPP2R2AmRNA和PPP2R2A蛋白表達(dá)的影響。
　　3.采用q-PCR和westemblot的方法檢測(cè)NSCLC組織中PPP2R2AmRNA和PP

13、P2R2A蛋白的表達(dá)情況。
　　4.結(jié)合臨床病理資料分析PPP2R2A表達(dá)與患者臨床病理特征是否有關(guān)聯(lián)。
　　5.通過(guò)在A549細(xì)胞中單獨(dú)過(guò)表達(dá)miR-136或者共同過(guò)表達(dá)PPP2R2A，結(jié)合westemblot檢測(cè)miR-136對(duì)Erk1/2的活化是否與PPP2R2A有關(guān)。
　　6.通過(guò)在A549細(xì)胞中單獨(dú)過(guò)表達(dá)miR-136或者共同過(guò)表達(dá)PPP2R2A，結(jié)合MTT實(shí)驗(yàn)檢測(cè)PPP2R2A是否影響miR-136誘導(dǎo)的細(xì)

14、胞增殖。
　　7.統(tǒng)計(jì)學(xué)處理:應(yīng)用SPSS13.0軟件處理數(shù)據(jù)，數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(x±s)，采用one-wayANOVA與student'st檢驗(yàn)各組間差異的顯著性，P＜0.05時(shí)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。兩個(gè)有序變量之間的相關(guān)性檢驗(yàn)用Spearman相關(guān)分析，兩分類(lèi)變量的比較用Pearson'sx2檢驗(yàn);以α=0.05為檢驗(yàn)水準(zhǔn)。P＜0.05時(shí)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　結(jié)果：
　　1.PicTar和TargetScan軟件分析預(yù)測(cè):

15、結(jié)果發(fā)現(xiàn)PPP2R2AmRNA3'UTR含有miR-136的可能結(jié)合位點(diǎn)，是miR-136的一個(gè)重要靶基因。
　　2.熒光素酶分析實(shí)驗(yàn):結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與對(duì)照miRNA相比，在A549中miR-136能夠顯著抑制含有野生型-3'UTR報(bào)告載體的熒光素酶活性，而對(duì)含有突變型-3'UTR的報(bào)告載體的熒光素酶活性沒(méi)有影響。
　　3.q-PCR和westemblot檢測(cè):結(jié)果顯示，抑制miR-136的表達(dá)后A549細(xì)胞中PPP2R2AmR

16、NA和PPP2R2A蛋白的表達(dá)水平均明顯增加。
　　4.q-PCR和westemblot檢測(cè):結(jié)果顯示，與正常組織相比，在NSCLC組織中PPP2R2AmRNA和PPP2R2A蛋白的表達(dá)降低，而且與miR-136的表達(dá)呈負(fù)相關(guān)。
　　5.病理學(xué)分析:結(jié)果提示miR-136表達(dá)與患者的年齡，性別及TNM級(jí)別沒(méi)有直接的關(guān)聯(lián)，但是，PPP2R2A與腫瘤的組織學(xué)分級(jí)有重要關(guān)系。
　　6.在A549細(xì)胞中過(guò)表達(dá)miR-136，P

17、PP2R2A的表達(dá)受到抑制，同時(shí)Erk1/2磷酸化水平上調(diào)。而共同過(guò)表達(dá)miR-136和PPP2R2A后，A549細(xì)胞中由miR-136誘導(dǎo)的Erk1/2磷酸化受到抑制。
　　7.在A549細(xì)胞中過(guò)表達(dá)miR-136，細(xì)胞增殖增加32％，而同時(shí)過(guò)表達(dá)miR-136和PPP2R2A后細(xì)胞增殖減少了44％。
　　結(jié)論：
　　1.miR-136在NSCLC組織及NSCLC細(xì)胞株中表達(dá)上調(diào)，提示miR-136的高表達(dá)與NSCL

18、C的發(fā)生有關(guān)。
　　2.抑制miR-136的表達(dá)能夠抑制NSCLC細(xì)胞的增殖，其作用機(jī)制可能與抑制Erk1/2的激活有關(guān)。
　　3.PPP2R2A是miR-136的靶基因，在NSCLC細(xì)胞株A549中抑制miR-136的表達(dá)，PPP2R2A的表達(dá)顯著增加。
　　4.過(guò)表達(dá)miR-136能夠促進(jìn)A549細(xì)胞的增殖，而同時(shí)過(guò)表達(dá)PPP2R2A則使miR-136誘導(dǎo)的細(xì)胞增殖發(fā)生逆轉(zhuǎn)。
　　5.miR-136通過(guò)抑制P