MicroRNA-10b在非小細(xì)胞肺癌中的表達(dá)及功能的研究.pdf

1、目的:越來(lái)越多的研究結(jié)果顯示，miRNA在肺癌的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中起著重要的作用。在本研究中，我們利用實(shí)時(shí)定量real time PCR技術(shù)檢測(cè)非小細(xì)胞肺癌組織相對(duì)于癌旁正常組織中 miR-10b的差異表達(dá)，并通觀察在肺癌細(xì)胞株中過(guò)表達(dá) miR-10b對(duì)肺癌細(xì)胞生長(zhǎng)、侵襲及轉(zhuǎn)移的影響，以及 miR-10b靶基因的預(yù)測(cè)及驗(yàn)證，初步探索miR-10b在非小細(xì)胞肺癌的發(fā)生、發(fā)展中的作用及其機(jī)制。
　　方法：
　　1，采用RT-PCR法

2、檢測(cè)miR-10b在非小細(xì)胞肺癌組織中的差異表達(dá)；
　　2,采用RT-PCR法檢測(cè)miR-10b在 A549細(xì)胞株、95-C細(xì)胞株中的表達(dá)情況，將實(shí)驗(yàn)分為三個(gè)組：空白對(duì)照組，陰性對(duì)照組，miR-10b質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組，構(gòu)建 miR-10b過(guò)表達(dá)質(zhì)粒及陰性對(duì)照質(zhì)粒，將miR-10b過(guò)表達(dá)質(zhì)粒及陰性對(duì)照質(zhì)粒采用脂質(zhì)體法瞬轉(zhuǎn)至A549及95-C細(xì)胞株中，轉(zhuǎn)染后熒光顯微鏡下觀察轉(zhuǎn)染效率，RT-PCR法檢測(cè)各組細(xì)胞中miR-10b的相對(duì)表達(dá)量。通

3、過(guò)細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)（CCK8）觀察轉(zhuǎn)染后各組細(xì)胞的增殖能力的變化；通過(guò)流式細(xì)儀檢測(cè)各組細(xì)胞的細(xì)胞周期及凋亡的變化，Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)檢測(cè)各組細(xì)胞侵襲能力的變化，細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)各組細(xì)胞遷移能力的變化；
　　3，使用生物信息學(xué)方法對(duì)miR-10b的靶基因進(jìn)行預(yù)測(cè)，并采用熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)、RT-PCR及Westblot進(jìn)行初步驗(yàn)證。
　　結(jié)果：
　　1，在40例非小細(xì)胞肺癌組織及配對(duì)的癌旁組織中，miR-10b在肺

4、癌組織中的表達(dá)高于癌旁組織（P<0.05），有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組miR-10b表達(dá)水平高于無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組(p<0.05)。
　　2，miR-10b在 A549細(xì)胞及95-C細(xì)胞中相對(duì)高表達(dá)(P<0.05)，轉(zhuǎn)染后miR-10b質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組細(xì)胞增殖速度明顯增快，細(xì)胞凋亡率降低，細(xì)胞侵襲及遷移能力增強(qiáng)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。
　　3，經(jīng)生物信息軟件預(yù)測(cè)，我們篩選出KLF4作為miR-10b的靶基因。我們構(gòu)建兩個(gè)KLF4的3'

5、UTR片段的熒光素酶報(bào)告基因載體，共轉(zhuǎn)染 miR-10b質(zhì)粒和KLF4-3'UTR-wt報(bào)告基因載體時(shí)，熒光素酶活性降低35％；共轉(zhuǎn)染 miR-10b質(zhì)粒和預(yù)測(cè)靶位點(diǎn)突變載體 KLF4-3'UTR-mut時(shí)，熒光素酶活性未見(jiàn)明顯改變。在A549細(xì)胞及95-C細(xì)胞株中miR-10b質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組 KLF4mRNA表達(dá)降低，但與空白對(duì)照組和陰性對(duì)照組比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；miR-10b質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組KLF4蛋白表達(dá)降低，與空白對(duì)照