MicroRNA-29b在非小細(xì)胞肺癌轉(zhuǎn)移中的作用及機(jī)制研究.pdf

1、研究背景與目的：
　　肺癌是目前人類(lèi)發(fā)病率及死亡率最高的惡性腫瘤。肺癌的主要病理類(lèi)型包括非小細(xì)胞肺癌和小細(xì)胞肺癌兩大類(lèi)，其中非小細(xì)胞肺癌占肺癌總數(shù)的80％～85%。導(dǎo)致非小細(xì)胞肺癌臨床治療失敗和患者死亡的主要原因之一是腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移。因此，深入研究非小細(xì)胞肺癌轉(zhuǎn)移過(guò)程的分子機(jī)制，尋找新的生物標(biāo)記物和治療靶標(biāo)，是當(dāng)前腫瘤研究領(lǐng)域的重要課題。
　　MicroRNA(miRNA)是一類(lèi)長(zhǎng)約22個(gè)核苷酸的非編碼單鏈 RNA，通過(guò)堿

2、基互補(bǔ)配對(duì)方式結(jié)合到靶基因mRNA的3’UTR，對(duì)靶基因mRNA進(jìn)行降解或者翻譯抑制，實(shí)現(xiàn)對(duì)靶基因表達(dá)水平的轉(zhuǎn)錄后調(diào)控。目前人類(lèi)基因組中已確認(rèn)的miRNA有2578個(gè)，可能參與人類(lèi)30%的蛋白表達(dá)調(diào)控，影響著幾乎所有的信號(hào)通路，與生長(zhǎng)發(fā)育以及許多疾病的發(fā)生發(fā)展息息相關(guān)。在腫瘤中，異常表達(dá)的miRNAs通過(guò)靶向癌基因或抑癌基因，發(fā)揮著類(lèi)似抑癌基因或癌基因的作用，參與癌變進(jìn)程的每一階段，包括腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移。
　　為篩選與非小細(xì)胞肺癌

3、轉(zhuǎn)移相關(guān)的因子，本研究利用免疫磁珠分選(magnetic activated cell sorting，MACS)技術(shù)從人肺腺癌細(xì)胞株A549細(xì)胞中分選出CD133陽(yáng)性和CD133陰性A549細(xì)胞株；利用miRNA PCR芯片和腫瘤轉(zhuǎn)移相關(guān)基因芯片從分選后未經(jīng)培養(yǎng)的兩株原代細(xì)胞中篩選出差異表達(dá)的 miRNAs和差異表達(dá)的轉(zhuǎn)移相關(guān)基因；應(yīng)用生物信息學(xué)技術(shù)對(duì)差異5倍以上的miRNAs進(jìn)行靶基因預(yù)測(cè)，再將預(yù)測(cè)得到的靶基因與差異表達(dá)的轉(zhuǎn)移相關(guān)基

4、因進(jìn)行比對(duì)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在CD133陽(yáng)性A549細(xì)胞表達(dá)明顯下調(diào)的7個(gè)miRNA中，microRNA-29b(miR-29b)的靶基因與轉(zhuǎn)移基因芯片中的差異基因交集最多，為4個(gè)。與CD133陰性細(xì)胞相比，CD133陽(yáng)性A549細(xì)胞中miR-29b表達(dá)下調(diào)了7.6倍，4個(gè)交集靶基因PTEN、ETV4、COL4A2、MMP2上調(diào)了1.11至4.20倍。由此，我們選擇miR-29b作為非小細(xì)胞肺癌轉(zhuǎn)移相關(guān)的候選miRNA，對(duì)miR-29b在非小

5、細(xì)胞肺癌轉(zhuǎn)移中的作用及其分子調(diào)控機(jī)制進(jìn)行研究，選擇與轉(zhuǎn)移密切相關(guān)的MMP2和PTEN進(jìn)行后續(xù)靶基因的驗(yàn)證，以期為基于miRNA的非小細(xì)胞肺癌的臨床診治工作提供科學(xué)依據(jù)。
　　研究方法：
　　1、非小細(xì)胞肺癌轉(zhuǎn)移相關(guān)miRNAs的篩選及表達(dá)驗(yàn)證
　?。?）利用miRNA PCR芯片從CD133陽(yáng)性和CD133陰性A549細(xì)胞中篩選出差異miRNAs表達(dá)譜。以差異倍數(shù)＞5的miRNAs為檢索詞，利用三個(gè)常用數(shù)據(jù)庫(kù)Micro

6、RNA.org、Targetscans和Pictar對(duì)其靶基因進(jìn)行預(yù)測(cè)，挑選出3個(gè)軟件交集的靶基因，再與通過(guò)腫瘤轉(zhuǎn)移相關(guān)基因芯片得到的兩株細(xì)胞間差異表達(dá)的轉(zhuǎn)移相關(guān)基因進(jìn)行比對(duì)，篩選與非小細(xì)胞肺癌轉(zhuǎn)移相關(guān)miRNAs。
　?。?）利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR的方法檢測(cè)miR-29b在非小細(xì)胞肺癌癌組織、配對(duì)癌旁組織和非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞株中的表達(dá)情況，統(tǒng)計(jì)分析miR-29b表達(dá)與非小細(xì)胞肺癌臨床病理特征的相關(guān)性。
　　2、miR-29b

7、對(duì)非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞生物學(xué)行為的影響
　　（1）利用表達(dá)miR-29b的慢病毒載體或?qū)φ章《据d體感染A549細(xì)胞，96孔板有限稀釋法挑選陽(yáng)性單克隆，建立穩(wěn)定過(guò)表達(dá) miR-29b的非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞株和對(duì)照細(xì)胞株。采用反復(fù)Transwell分離高低轉(zhuǎn)移能力的非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞株A549-H和A549-L。利用陽(yáng)離子脂質(zhì)體法，將miR-29b mimic瞬時(shí)轉(zhuǎn)染至內(nèi)源性低表達(dá)miR-29b非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞株A549-H中。利用CCK-8

8、法、Transwell小室遷移實(shí)驗(yàn)及Boyden小室侵襲實(shí)驗(yàn)檢測(cè)過(guò)表達(dá)miR-29b對(duì)非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞A549和A549-H生長(zhǎng)、遷移及侵襲能力的影響；裸鼠皮下成瘤實(shí)驗(yàn)檢測(cè)穩(wěn)定過(guò)表達(dá)miR-29b的非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞的裸鼠皮下成瘤能力。
　　（2）利用陽(yáng)離子脂質(zhì)體法，將miR-29b inhibitor瞬時(shí)轉(zhuǎn)染至內(nèi)源性高表達(dá)miR-29b非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞株H460和A549-L中，利用CCK-8法、Transwell小室遷移實(shí)驗(yàn)及B

9、oyden小室侵襲實(shí)驗(yàn)檢測(cè)抑制miR-29b對(duì)非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞H460和A549-L生長(zhǎng)、遷移及侵襲能力的影響。利用表達(dá)miR-29b inhibitor的慢病毒載體或?qū)φ章《据d體感染 H460細(xì)胞，經(jīng)流式細(xì)胞儀分選建立穩(wěn)定抑制miR-29b表達(dá)的非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞株和對(duì)照細(xì)胞株。裸鼠皮下成瘤實(shí)驗(yàn)檢測(cè)穩(wěn)定抑制miR-29b表達(dá)的非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞的裸鼠皮下成瘤能力。
　　3、miR-29b靶基因的鑒定
　?。?）分別構(gòu)建融合M

10、MP2、PTEN基因野生型和突變型3’UTR的熒光素酶報(bào)告基因載體，應(yīng)用熒光素酶報(bào)告檢測(cè)系統(tǒng)對(duì)miR-29b與MMP2、PTEN相互作用進(jìn)行驗(yàn)證。
　?。?）利用陽(yáng)離子脂質(zhì)體法，將miR-29b mimic或miR-29b inhibitor瞬時(shí)轉(zhuǎn)染至非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞株中，利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR和Western blot檢測(cè)過(guò)表達(dá)和抑制miR-29b對(duì)MMP2、PTEN mRNA和蛋白表達(dá)水平的影響，并對(duì)miR-29b和MMP2在

11、非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞中的表達(dá)進(jìn)行相關(guān)性分析。
　　4、miR-29b上游轉(zhuǎn)錄因子的預(yù)測(cè)和鑒定
　　通過(guò) Ensembl數(shù)據(jù)庫(kù)在線(xiàn)獲取 miR-29b基因上游啟動(dòng)子序列，利用四個(gè)常用數(shù)據(jù)庫(kù)Proscan、Consit、TFSEARCH及TRED預(yù)測(cè)及分析可能與miR-29b啟動(dòng)子結(jié)合的轉(zhuǎn)錄因子。構(gòu)建過(guò)表達(dá)轉(zhuǎn)錄因子的質(zhì)粒載體和融合miR-29b啟動(dòng)子序列的熒光素酶表達(dá)載體，利用熒光素酶報(bào)告檢測(cè)系統(tǒng)檢測(cè)轉(zhuǎn)錄因子對(duì) miR-29b啟動(dòng)子

12、轉(zhuǎn)錄活性的影響。利用陽(yáng)離子脂質(zhì)體法，將過(guò)表達(dá)轉(zhuǎn)錄因子的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞株中，利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR和Western blot檢測(cè)轉(zhuǎn)錄因子對(duì)miR-29b和MMP2表達(dá)水平的影響。
　　研究結(jié)果：
　　1、非小細(xì)胞肺癌轉(zhuǎn)移相關(guān)miRNAs的篩選及表達(dá)驗(yàn)證
　?。?）與CD133陰性細(xì)胞相比，CD133陽(yáng)性A549細(xì)胞表達(dá)差異達(dá)兩倍或以上的 miRNAs有51個(gè)，差異倍數(shù)＞5的有10個(gè) miRNAs，分別是表達(dá)下

13、調(diào)的has-miR-337-3p，has-miR-33a，has-miR-32，has-miR-374b，has-miR-29b，has-miR-559，has-miR-219-5p和表達(dá)上調(diào)的 has-miR-1，has-miR-512-5p，has-miR-639。通過(guò)三個(gè)常用數(shù)據(jù)庫(kù)預(yù)測(cè)7個(gè)表達(dá)下調(diào) miRNA的靶基因，發(fā)現(xiàn)has-miR-29b的4個(gè)靶基因包含在 CD133陽(yáng)性和CD133陰性A549細(xì)胞之間差異表達(dá)的轉(zhuǎn)移相關(guān)基因

14、中，CD133陽(yáng)性A549細(xì)胞中miR-29b表達(dá)下調(diào)了7.6倍，靶基因PTEN、ETV4、COL4A2、MMP2等上調(diào)了1.11至4.2倍。于是，我們選定hsa-miR-29b作為研究對(duì)象，選擇與轉(zhuǎn)移密切相關(guān)的MMP2、PTEN進(jìn)行靶基因的鑒定。
　　（2）實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)結(jié)果顯示，在20對(duì)配對(duì)非小細(xì)胞肺癌石蠟組織中，癌組織中miR-29b的表達(dá)顯著低于癌旁肺組織(P=0.001，t=-3.817)；miR-29b在10例

15、新鮮非小細(xì)胞肺癌組織的表達(dá)顯著低于配對(duì)癌旁肺組織(P<0.001，t=-9.016)。以永生化的人支氣管上皮細(xì)胞16HBE為對(duì)照，miR-29b在9種非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞株中的表達(dá)具有顯著性差異(F=99.444，P<0.001)；與16HBE細(xì)胞比較，miR-29b在 PAa、PGCL3、H520、A549、H1299、95D等6種細(xì)胞株中的表達(dá)顯著降低(P=0.002；P=0.001；P=0.001；P=0.000；P=0.000；P=

16、0.000)；在H460細(xì)胞中的表達(dá)顯著高于其他8種非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞株(P=0.000；P=0.000；P=0.000；P=0.000；P=0.000；P=0.000；P=0.000；P=0.000)。miR-29b在30例非小細(xì)胞肺癌組織中的表達(dá)與患者年齡、性別、組織學(xué)分型以及腫瘤分化程度均無(wú)顯著性相關(guān)(P=0.578；P=0.862；P=0.625；P=0.891)，與臨床分期和有無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有顯著性相關(guān)(P=0.004；P=0.0

17、31)，Pearson相關(guān)分析顯示，miR-29b表達(dá)與有無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移呈負(fù)相關(guān)(r=-0.547，P=0.043)。
　　2、miR-29b對(duì)非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞生物學(xué)行為的影響
　　2.1 miR-29b過(guò)表達(dá)對(duì)非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞體內(nèi)外生物學(xué)行為的影響
　?。?）建立了穩(wěn)定過(guò)表達(dá) miR-29b的非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞株A549-miR-29b-Clone2和對(duì)照細(xì)胞株 A549-NC。實(shí)時(shí)熒光定量 PCR檢測(cè)結(jié)果表明，A549

18、-miR-29b-Clone2細(xì)胞株中miR-29b的表達(dá)顯著高于 A549細(xì)胞(P<0.001)，而A549-NC細(xì)胞株中miR-29b的表達(dá)與A549細(xì)胞相比沒(méi)有顯著性差異(P=0.945)。
　　（2）采用反復(fù) Transwell實(shí)驗(yàn)獲得了高低轉(zhuǎn)移能力的非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞株A549-H和A549-L。在體外遷移和侵襲實(shí)驗(yàn)中，A549-H細(xì)胞穿過(guò)小室膜的細(xì)胞數(shù)目明顯多于 A549-L細(xì)胞(t=-32.220，P<0.001；t=

19、-28.461，P<0.001)。A549-H細(xì)胞中miR-29b的表達(dá)顯著低于A549-L細(xì)胞(P=0.001)。相對(duì)于Blank組與NC組，A549-H細(xì)胞組在轉(zhuǎn)染miR-29b mimic后miR-29b表達(dá)顯著升高(P=0.044，P=0.044)。
　　（3）采用CCK-8法檢測(cè)miR-29b對(duì)細(xì)胞體外增殖能力的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與A549和A549-NC細(xì)胞組相比，穩(wěn)定過(guò)表達(dá)miR-29b的A549-miR-29b-Cl

20、one2細(xì)胞組的增殖能力顯著降低(F=124.596，P<0.001)。同樣，與Blank組與NC組相比，A549-H細(xì)胞組在轉(zhuǎn)染miR-29b mimic后增殖能力顯著降低(F=10.343，P<0.001)。說(shuō)明過(guò)表達(dá)miR-29b可以抑制非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞的增殖。
　　（4）Transwell小室遷移實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞體外遷移運(yùn)動(dòng)能力的變化，結(jié)果發(fā)現(xiàn)與A549和A549-NC細(xì)胞組相比，A549-miR-29b-Clone2細(xì)胞組穿

21、過(guò)膜的細(xì)胞數(shù)目顯著減少(F=31.613，P<0.001)。同樣，與Blank組與NC組相比，A549-H細(xì)胞在轉(zhuǎn)染miR-29b mimic后遷移運(yùn)動(dòng)能力顯著降低(F=103.302,P<0.001)。Boyden小室侵襲實(shí)驗(yàn)分析細(xì)胞體外侵襲能力的變化，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與 A549和A549-NC細(xì)胞組相比，A549-miR-29b-Clone2細(xì)胞穿過(guò)基質(zhì)膠的細(xì)胞數(shù)目顯著減少(F=347.905，P<0.001)。同樣，與 Blank組與

22、 NC組相比，A549-H細(xì)胞在轉(zhuǎn)染miR-29b mimic后侵襲能力顯著降低(F=145.361,P<0.001)。說(shuō)明過(guò)表達(dá)miR-29b可以抑制非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞的遷移和侵襲能力。
　　（5）裸鼠皮下成瘤實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，與 A549和A549-NC細(xì)胞組相比，A549-miR-29b-Clone2細(xì)胞組裸鼠皮下瘤體重量顯著減輕(Welch=24.125，P<0.001)，腫瘤生長(zhǎng)速度顯著減慢(F=29.782，P<0.001)

23、，體積也顯著縮小(F=58.302，P<0.001)。說(shuō)明miR-29b在體內(nèi)可以抑制非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞的增殖和成瘤能力。
　　2.2miR-29b inhibitor對(duì)非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞體內(nèi)外生物學(xué)行為的影響
　?。?）與Blank組與NC組比較，瞬時(shí)轉(zhuǎn)染miR-29b inhibitor后H460和A549-L細(xì)胞內(nèi)的miR-29b的表達(dá)量顯著下降(F=10.176，P=0.012；F=7.321，P=0.025)。

24、　?。?）采用CCK-8法檢測(cè)miR-29b抑制后H460和A549-L細(xì)胞體外增殖能力的改變，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與Blank組與 NC組細(xì)胞比較，miR-29b抑制后的H460和A549-L細(xì)胞增殖速度顯著加快(F=86.935，P<0.001；F=80.856，P<0.001)。說(shuō)明抑制miR-29b能促進(jìn)非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞的體外增殖。
　?。?）Transwell小室遷移實(shí)驗(yàn)檢測(cè)miR-29b抑制后細(xì)胞體外遷移運(yùn)動(dòng)能力的變化，結(jié)果發(fā)現(xiàn)

25、，與Blank組與NC組細(xì)胞比較，miR-29b抑制后的H460和A549-L細(xì)胞穿過(guò)膜的細(xì)胞數(shù)顯著增加(F=44.107，P<0.001；F=463.750，P<0.001)。Boyden小室侵襲實(shí)驗(yàn)分析miR-29b抑制后細(xì)胞體外侵襲能力的變化，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與Blank組與NC組細(xì)胞比較，miR-29b抑制后的H460和A549-L細(xì)胞穿過(guò)基質(zhì)膠的細(xì)胞數(shù)顯著增加(F=30.898，P<0.001；F=9.413，P<0.001)。說(shuō)明

26、抑制miR-29b能促進(jìn)非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞的體外遷移和侵襲能力。
　　（4）建立了穩(wěn)定抑制 miR-29b表達(dá)的非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞株 H460-miR-29b-inhibitor和對(duì)照細(xì)胞株 H460-NC。裸鼠皮下成瘤實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，與 H460和H460-NC細(xì)胞組相比，H460-miR-29b-inhibitor細(xì)胞組裸鼠皮下瘤體重量顯著增加(Welch=16.773，P=0.002)，腫瘤生長(zhǎng)速度顯著增快(F=41.778，P<

27、0.001)，體積也顯著增大(F=17.267，P<0.001)。說(shuō)明miR-29b抑制后可以增強(qiáng)非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞在體內(nèi)的增殖和成瘤能力。
　　3、miR-29b靶基因的鑒定
　?。?）成功構(gòu)建了融合 MMP2及 PTEN基因野生型和突變型3’UTR的psiCHECK-2-MMP23’UTR與psiCHECK-2-Mut-MMP23’UTR載體、psiCHECK-2-PTEN3’UTR與psiCHECK-2–Mut1-3-P

28、TEN3’UTR載體。
　?。?）在轉(zhuǎn)染MMP2基因野生型3’UTR載體實(shí)驗(yàn)組中，miR-29b mimic組與Blank組、NC組相比熒光素酶活性均顯著降低(P=0.023，P=0.018)；在轉(zhuǎn)染MMP2基因3’UTR突變載體的實(shí)驗(yàn)組中，miR-29b mimic組與blank組、NC組相比熒光素酶活性無(wú)顯著差異(P=0.166，P=0.111)，說(shuō)明miR-29b能與MMP2基因3’UTR直接結(jié)合，從而抑制了熒光素酶的活性。

29、
　　（3）在轉(zhuǎn)染PTEN基因野生型3’UTR載體的實(shí)驗(yàn)中，miR-29b mimic組與Blank組、NC組相比，熒光素酶活性均顯著降低(P=0.000，P=0.031)；在轉(zhuǎn)染psiCHECK-2-Mut-1-PTEN3’UTR或psiCHECK-2-Mut-2-PTEN3’UTR載體的實(shí)驗(yàn)中，miR-29b mimic組與Blank組、NC組相比，熒光素酶活性均顯著降低(P=0.000，P=0.000；P=0.000，P=0

30、.000)，在轉(zhuǎn)染psiCHECK-3-Mut-3-PTEN3’UTR載體的實(shí)驗(yàn)中，miR-29b mimic組與Blank組、NC組相比，熒光素酶活性沒(méi)有顯著改變(P=0.540，P=0.238)，說(shuō)明miR-29b可以和野生型PTEN3’UTR兩個(gè)結(jié)合位點(diǎn)直接結(jié)合從而抑制熒光素酶活性。
　?。?）與 A549-NC細(xì)胞和A549細(xì)胞相比，穩(wěn)定過(guò)表達(dá) miR-29b的A549-miR-29b-Clone2細(xì)胞中MMP2 mRNA

31、表達(dá)顯著降低(F=19.372，P=0.002)，MMP2蛋白表達(dá)也明顯下調(diào)(F=146.189，P<0.001)；A549-H細(xì)胞轉(zhuǎn)染 miR-29b mimic后，與 NC組相比，細(xì)胞中miR-29b的表達(dá)顯著升高(P<0.001)，MMP2 mRNA表達(dá)顯著降低(P=0.048)，MMP2蛋白表達(dá)也明顯下調(diào)(P<0.001)。H460和A549-L細(xì)胞在miR-29b inhibitor轉(zhuǎn)染后，與Blank組和NC組相比，細(xì)胞中m

32、iR-29b的表達(dá)顯著降低(F=10.176，P=0.012；F=7.321，P=0.025)，MMP2 mRNA表達(dá)顯著升高(F=48.327，P=0.001；F=59.997，P=0.001)，MMP2蛋白表達(dá)也明顯上調(diào)(F=59.997，P=0.001；F=25.384，P=0.018)。說(shuō)明miR-29b可負(fù)調(diào)控MMP2的表達(dá)。
　?。?）與 A549-NC細(xì)胞和A549細(xì)胞相比，穩(wěn)定過(guò)表達(dá) miR-29b的A549-mi

33、R-29b-Clone2細(xì)胞中PTEN mRNA和蛋白表達(dá)無(wú)顯著差異(F=4.835，P=0.056；F=1.041，P=0.409)；A549-H細(xì)胞轉(zhuǎn)染miR-29b mimic后，與Blank組和NC組相比，細(xì)胞中PTEN mRNA和蛋白表達(dá)也沒(méi)有顯著差異(F=0.320，pP=0.738；F=3.599，P=0.173)。H460和A549-L細(xì)胞在miR-29b inhibitor轉(zhuǎn)染后，與 Blank組和NC組相比，細(xì)胞中P

34、TEN mRNA和蛋白表達(dá)均無(wú)有顯著差異(F=0.541，P=0.608；F=1.142，P=0.380；F=1.179，P=0.370；F=3.040，P=0.196)。但過(guò)表達(dá)miR-29b可使A549和A549-H細(xì)胞中PTEN蛋白表達(dá)出現(xiàn)下調(diào)趨勢(shì)，反之，抑制內(nèi)源性miR-29b表達(dá)則可H460和A549-L細(xì)胞中PTEN蛋白表達(dá)出現(xiàn)上調(diào)趨勢(shì)。
　?。?）實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)結(jié)果顯示miR-29b在H460細(xì)胞中的表達(dá)最高

35、，在A549-L、A549、A549-H細(xì)胞中的表達(dá)依次降低，Western blot檢測(cè)結(jié)果顯示MMP2蛋白在A549-H細(xì)胞中的表達(dá)最高，在A549、A549-L、H460細(xì)胞中的表達(dá)依次降低，Spearman相關(guān)性分析顯示miR-29b與MMP2蛋白在以上四種非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞株中存在顯著的負(fù)相關(guān)關(guān)系(r=-0.902，P<0.001)。
　　4、miR-29b上游轉(zhuǎn)錄因子的預(yù)測(cè)和鑒定
　?。?）通過(guò)Ensembl數(shù)據(jù)庫(kù)

36、在線(xiàn)獲取編碼miR-29b前體mir-29b-1序列所在基因的上游2kb作為mir-29b-1啟動(dòng)子序列。
　?。?）利用四個(gè)常用數(shù)據(jù)庫(kù)Proscan、Consit、TFSEARCH及TRED預(yù)測(cè)及分析可能與mir-29b啟動(dòng)子結(jié)合的轉(zhuǎn)錄因子，綜合四個(gè)軟件的預(yù)測(cè)結(jié)果，挑選分值較高，且四個(gè)軟件均有交集的轉(zhuǎn)錄因子 SRF作為miR-29b的轉(zhuǎn)錄因子。
　　（3）成功構(gòu)建了過(guò)表達(dá)SRF的SRF-EGFP-N1載體和融合miR-29

37、b啟動(dòng)子序列的miR-29b promoter-PGL3-Basic載體。熒光素酶報(bào)告檢測(cè)系統(tǒng)結(jié)果顯示：HEK293A細(xì)胞轉(zhuǎn)染miR-29b promoter-PGL3-Basic后，熒光素酶活性較對(duì)照組明顯增強(qiáng)(P=0.014)，說(shuō)明 miR-29b啟動(dòng)子序列具有轉(zhuǎn)錄活性。共轉(zhuǎn)染 miR-29b promoter-PGL3-Basic和SRF-pEGFP-N1后，熒光素酶活性較單轉(zhuǎn)染 miR-29b promoter-PGL3-Bas

38、ic組顯著降低(P=0.024)，表明轉(zhuǎn)錄因子SRF能抑制 miR-29b啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄活性。
　?。?）利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR和Western blot檢測(cè)轉(zhuǎn)染過(guò)表達(dá)SRF質(zhì)粒后，A549及 H460細(xì)胞中miR-29b和MMP2的表達(dá)，結(jié)果顯示，兩種細(xì)胞中SRF mRNA的表達(dá)顯著升高(t=-4.326，P=0.012； t=-7.774，P=0.001)，證實(shí)轉(zhuǎn)染成功。兩種細(xì)胞中miR-29b的表達(dá)較對(duì)照組顯著降低(t=13.

39、492，P<0.001； t=3.790，P=0.019)，MMP2 mRNA的表達(dá)較對(duì)照組顯著升高(t=-3.440，P=0.026； t=-5.931，P=0.004)，MMP2蛋白表達(dá)顯著上調(diào)(t=-8.794，P=0.001； t=-10.502，P=0.001)，提示 SRF能抑制miR-29b的表達(dá)，促進(jìn)MMP2蛋白的表達(dá)。
　　結(jié)論：
　　1、利用miRNA PCR芯片和腫瘤轉(zhuǎn)移相關(guān)基因芯片相結(jié)合，綜合生物信息

40、學(xué)分析，成功篩選出非小細(xì)胞肺癌轉(zhuǎn)移相關(guān)的miRNA——miR-29b，miR-29b在非小細(xì)胞肺癌組織和細(xì)胞株中表達(dá)下調(diào)，且其表達(dá)與非小細(xì)胞肺癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移呈負(fù)相關(guān)。
　　2、過(guò)表達(dá)miR-29b能抑制非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞體內(nèi)外的增殖、遷移及侵襲能力，而降低 miR-29b的表達(dá)能促進(jìn)非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞體內(nèi)外的增殖、遷移及侵襲能力。提示miR-29b在非小細(xì)胞肺癌中扮演了抑癌基因的角色。
　　3、在非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞中，MMP2是mi