microRNA-125a和microRNA-29a-b-c在胎盤植入中病理作用機(jī)制的研究.pdf

1、本文分為以下幾個(gè)章節(jié)進(jìn)行探討：
　　第一章 胎盤植入中microRNA-125a，microRNA-29a/b/c和MCL1表達(dá)水平分析
　　目的：
　　1.檢測并分析miR-125a和miR-29a/b/c在胎盤植入部分與自身鄰近非植入組織中的表達(dá)是否存在差異。
　　2.檢測并分析植入和自身鄰近非植入組織中MCL1基因mRNA水平的表達(dá)及差異，并分析MCL1與miR-125a和miR-29a/b/c表達(dá)相關(guān)性。

2、
　　3.探討MCL1是否作為miR-125a和miR-29a/b/c的靶基因在胎盤植入中發(fā)揮作用。
　　方法：
　　1.采用自身對照的配對設(shè)計(jì)，收集新鮮未經(jīng)任何干預(yù)處理的母體面胎盤絨毛、類纖維蛋白層及基板層，植入部分還包括基板子宮肌層纖維。
　　2.提取組織中總RNA，應(yīng)用實(shí)時(shí)熒光定量逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈(RT-qPCR)反應(yīng)檢測胎盤植入部分及自身鄰近非植入部分組織中miR-125a，miR-29a/b/c和MCL1

3、的表達(dá)。
　　3.應(yīng)用載體(pmirGLO Dual-Luciferase miRNA Target Expression Vector,pmirGLO)構(gòu)建野生型MCL1-miR-125a-pmirGLO質(zhì)粒(WT-125)和野生型MCL1-miR-29a/b/c-pmirGLO質(zhì)粒(WT-29)。突變野生型質(zhì)粒中的種子區(qū)序列部分堿基成為突變型MCL1-miR-125a-pmirGLO質(zhì)粒(MUT-125)和突變型MCL1-mi

4、R-29a/b/c-pmirGLO質(zhì)粒(MUT-29)。用化學(xué)合成方法以miR-125a或miR-29a/b/c成熟核苷酸序列為模板分別合成microRNA模擬物，通過脂質(zhì)體Lipofectamine3000將miR-125a模擬物與WT-125或者M(jìn)UT-125共轉(zhuǎn)染入293T細(xì)胞，將miR-29a/b/c與WT-29或者M(jìn)UT-29共轉(zhuǎn)染入293T細(xì)胞。
　　4.雙熒光素酶報(bào)告基因檢測探討MCL1與miR-125a和miR-2

5、9a/b/c的靶基因關(guān)系。
　　結(jié)果：
　　1.MiR-125a和miR-29a/b/c在胎盤植入部分組織中的表達(dá)水平明顯低于自身鄰近非植入部分組織，對應(yīng)的表達(dá)倍數(shù)分別是0.64;0.63;0.64;0.75(p=0.005;0.018;0.041;0.022)。
　　2.MCL1基因的mRNA在胎盤植入部分組織中表達(dá)水平明顯高于自身鄰近非植入部分組織，表達(dá)倍數(shù)為1.32(p=0.039)。
　　3.Pearso

6、n相關(guān)分析表明，胎盤植入組織中miR-125a和miR-29a/b/c的相對表達(dá)量與MCL1的相對表達(dá)量呈顯著負(fù)相關(guān)性(Pearson correlation=-0.701,-0.543,-0.876,-0.767, p＜0.05)。
　　4.雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(luciferase activity assays)證實(shí)MCL1是miR-125a和miR-29a/b/c的靶基因(p=0.043，0.006，0.009，0.01

7、0)。
　　結(jié)論：
　　MiR-125a和miR-29a/b/c在胎盤植入組織較自身鄰近非植入組織表達(dá)水平顯著降低，相反MCL1 mRNA在胎盤植入部分組織中表達(dá)顯著增高，兩者在胎盤植入中的相對表達(dá)量呈明顯的負(fù)相關(guān)性。雙熒光素酶報(bào)告基因檢測證實(shí)MCL1是miR-125a和miR-29a/b/c的靶基因，推測miR-125a，miR-29a/b/c通過調(diào)控靶基因MCL1表達(dá)參與胎盤植入發(fā)生。
　　第二章 胎盤植入中mic

8、roRNA-125a和microRNA-29a/b/c調(diào)控滋養(yǎng)細(xì)胞生物學(xué)行為的研究
　　目的：
　　1.體外轉(zhuǎn)染滋養(yǎng)細(xì)胞系HTR-8/SVneo細(xì)胞，進(jìn)一步驗(yàn)證miR-125a和miR-29a/b/c對靶基因MCL1的負(fù)性調(diào)節(jié)作用。
　　2.探討miR-125a和miR-29a/b/c異常表達(dá)對滋養(yǎng)細(xì)胞凋亡生物學(xué)行為的影響。
　　3.確定抗凋亡滋養(yǎng)細(xì)胞的類型，初步探討miR-125a和miR-29a/b/c在胎盤

9、植入中的病理作用機(jī)制。
　　方法：
　　1.以miR-125a和miR-29a/b/c成熟核苷酸序列為模板，用化學(xué)合成方法分別合成microRNA的模擬物(miR-125a mimic，miR-29a/b/c mimics)，反義的microRNA抑制物(miR-125a inhibitor, miR-29a/b/c inhibitors)以及各自對應(yīng)的陰性對照序列(negative control,NC，inhibitor

10、 negative control，INC)。通過脂質(zhì)體Lipofectamine3000分別將模擬物、抑制物及各自對應(yīng)的陰性對照序列轉(zhuǎn)染滋養(yǎng)細(xì)胞系HTR-8/SVneo。
　　2.應(yīng)用RT-qPCR反應(yīng)檢測microRNAs轉(zhuǎn)染后HTR-8/SVneo細(xì)胞中MCL1 mRNA水平表達(dá)量的變化。應(yīng)用Western Blot方法檢測轉(zhuǎn)染后HTR-8/SVneo細(xì)胞中Mcl1蛋白水平表達(dá)量的變化。
　　3.應(yīng)用AnnexinⅤ/

11、PI對轉(zhuǎn)染后的HTR-8/SVneo細(xì)胞進(jìn)行雙染，應(yīng)用流式細(xì)胞儀檢測HTR-8/SVneo細(xì)胞凋亡率。
　　4.對切除的子宮和胎盤組織進(jìn)行組織病理切片，免疫組化染色病理組織切片定位Mcl1表達(dá)細(xì)胞類型，結(jié)合H&E染色觀察細(xì)胞形態(tài)、數(shù)量。
　　結(jié)果：
　　1.轉(zhuǎn)染HTR-8/SVneo細(xì)胞后，miR-125a和miR-29a/b/c模擬物轉(zhuǎn)染組中MCL1 mRNA表達(dá)水平較陰性對照組明顯下降，表達(dá)倍數(shù)為0.60，0.42

12、，0.58，0.43(p=0.0497，0.002，0.008，0.013);模擬物轉(zhuǎn)染組中MCL1的蛋白表達(dá)水平也明顯降低。
　　2.MiR-125a和miR-29a/b/c模擬物轉(zhuǎn)染后，HTR-8/SVneo細(xì)胞凋亡率較陰性對照組呈現(xiàn)增長趨勢。
　　3.H&E染色和免疫組化染色病理切片均觀察到種植部位中間型滋養(yǎng)細(xì)胞(ISIT)數(shù)量在植入部分基板子宮肌層纖維間隙明顯增多，免疫組化染色顯示MCL1主要在ISIT中表達(dá)。顯微鏡

13、下發(fā)現(xiàn)，相比于非植入部分，植入部分中間型滋養(yǎng)細(xì)胞細(xì)胞遷移至深部肌層內(nèi)血管壁內(nèi)現(xiàn)象更常見。
　　結(jié)論：
　　MiR-125a或miR-29a/b/c的過表達(dá)可顯著降低MCL1基因mRNA和蛋白的表達(dá)并促進(jìn)HTR-8/SVneo細(xì)胞的凋亡。植入部分基板子宮肌層纖維間隙中主要表達(dá)MCL1的ISIT數(shù)量明顯增多。以上結(jié)果提示植入胎盤組織中miR-125a和miR-29a/b/c對靶基因MCL1異常調(diào)控導(dǎo)致植入部分基板子宮肌層纖維間隙