MicroRNA-148a-b在胃癌中的表達(dá)及其功能與機(jī)制研究.pdf

1、【背景】
　　MicroRNA是近年發(fā)現(xiàn)的一類長(zhǎng)約21-25個(gè)核苷酸片段的非編碼的小分子RNA，其通過(guò)與靶mRNA3‘非翻譯區(qū)結(jié)合，在轉(zhuǎn)錄后水平形成RNA誘導(dǎo)的基因沉默復(fù)合體影響mRNA的翻譯，從而發(fā)揮其生物學(xué)功能，影響生物體發(fā)育，細(xì)胞增殖、凋亡、分化等。其在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展方面也有著重要的作用。胃癌作為世界上發(fā)病率第四、腫瘤相關(guān)性死亡率第二的疾病，像其它惡性腫瘤一樣，其發(fā)生、發(fā)展也受遺傳學(xué)和表觀遺傳學(xué)多級(jí)聯(lián)的復(fù)雜調(diào)控。雖然很多研

2、究證明microRNA與胃癌存在密切的相關(guān)性，但其在胃癌的功能及潛在的機(jī)制仍然不明。一些研究已經(jīng)證實(shí)胃癌組織中存在很多microRNA分子的差異表達(dá)，并且發(fā)揮著促癌基因或抑癌基因的作用。我們參考國(guó)內(nèi)外相關(guān)文獻(xiàn)關(guān)于胃癌microRNA表達(dá)譜的研究，初步預(yù)測(cè)microRNA-148a/b在胃癌中存在著差異表達(dá)，并發(fā)揮著特殊的生物學(xué)功能。本課題將對(duì)microRNA-148a/b在胃癌的表達(dá)水平及功能與作用機(jī)制進(jìn)行初步的探討。
　　【目的

3、】
　　1、檢測(cè)microRNA-148a/b在胃癌組織中的表達(dá)水平。
　　2、研究microRNA-148a/b在胃癌中的功能。
　　3、構(gòu)建microRNA-148a/b慢病毒表達(dá)載體。
　　4、探討microRNA-148a/b在胃癌發(fā)揮功能的可能機(jī)制。
　　【方法】
　　1、收集23例胃癌患者手術(shù)切除后的腫瘤組織及癌旁組織標(biāo)本，提取組織中的總RNA，qPCR檢測(cè)microRNA-148a/b在

4、癌組織和癌旁組織中的相對(duì)表達(dá)量，使用相對(duì)定量法分析其表達(dá)差異。
　　2、運(yùn)用microRNA-148a/b-mimics化學(xué)合成物，通過(guò)脂質(zhì)體瞬時(shí)轉(zhuǎn)染的方法，轉(zhuǎn)染人胃癌MKN28，SGC7901細(xì)胞，使胃癌細(xì)胞內(nèi)microRNA-148a/b水平升高，進(jìn)行劃痕和transwell遷移實(shí)驗(yàn)，測(cè)定其對(duì)胃癌細(xì)胞遷移能力的影響。
　　3、構(gòu)建microRNA-148a/b慢病毒過(guò)表達(dá)載體，經(jīng)測(cè)序鑒定正確后，進(jìn)行病毒的包裝與滴度檢測(cè)。

5、并用構(gòu)建好的microRNA-148a/b慢病毒表達(dá)載體感染人胃癌SGC7901細(xì)胞，qPCR鑒定microRNA-148a/b在感染細(xì)胞中的表達(dá)效果。
　　4、運(yùn)用生物信息學(xué)分析軟件TargetScan、MiRanda預(yù)測(cè)microRNA-148a/b可能的靶基因，并對(duì)預(yù)測(cè)結(jié)果應(yīng)用DAVID數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行功能聚類分析，選擇與抑制細(xì)胞侵襲、遷移能力相關(guān)的抑癌相關(guān)基因。對(duì)其預(yù)測(cè)的靶基因編碼蛋白用Western-blot方法進(jìn)行檢測(cè)其在m

6、icroRNA-148a/b上調(diào)胃癌細(xì)胞MKN28內(nèi)的表達(dá)變化。
　　【結(jié)果】
　　1、MicroRNA-148a/b在胃癌組織中表達(dá)顯著低于相對(duì)應(yīng)的癌旁組織。
　　2、劃痕實(shí)驗(yàn)和transwell實(shí)驗(yàn)提示，運(yùn)用miR-148a/b-mimics通過(guò)脂質(zhì)體瞬時(shí)轉(zhuǎn)染使胃癌細(xì)胞MKN28和SGC7901內(nèi)miR-148a/b升高，腫瘤細(xì)胞遷移能力顯著減弱。
　　3、成功構(gòu)建了microRNA-148a和microRN

7、A-148b的兩個(gè)慢病毒表達(dá)載體，經(jīng)雙酶切電泳及測(cè)序鑒定正確。用構(gòu)建好的慢病毒載體感染人胃癌SGC7901細(xì)胞，qPCR鑒定其表達(dá)效果，結(jié)果顯示能顯著上調(diào)microRNA-148a/b在細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)水平。
　　4、生物信息學(xué)預(yù)測(cè)顯示PrPc為microRNA-148a/b的可能靶基因之一，Western-bolt結(jié)果顯示，在microRNA-148a/b上調(diào)的胃癌細(xì)胞MKN28內(nèi)，PrPc表達(dá)顯著降低。
　　【結(jié)論】