MG5的表達(dá),鑒定以及在胃癌中的功能機(jī)制研究.pdf

1、背景：我國是胃癌的高發(fā)區(qū)，腫瘤標(biāo)志物，尤其是癌前預(yù)警分子和早診分子是提高胃癌生存率的重要診斷工具，但是目前尚缺乏這樣的分子標(biāo)志物。我實(shí)驗(yàn)室前期制備并初步篩選了MG5-Ab,MG7-Ab等一系列胃癌相關(guān)的單抗，顯示出很好的臨床應(yīng)用前景。但還缺乏較大規(guī)模的回顧性研究以及抗原鑒定等基礎(chǔ)性研究。
　　目的：研究MG5在預(yù)警，早診和預(yù)后方面的臨床價值；鑒定MG5的抗原本質(zhì)；探究MG5在胃癌中的生物學(xué)功能以及相關(guān)分子機(jī)制。
　　方法：I

2、HC法檢測MG5在大規(guī)模癌前病變(N=509；467)以及腫瘤組織中(n=747)的表達(dá)，統(tǒng)計(jì)學(xué)分析MG5表達(dá)與癌前進(jìn)展、胃癌發(fā)生、預(yù)后的相關(guān)性；WB、IP、MS、IF、慢病毒感染等方法鑒定MG5抗體特異性識別的抗原；MTT，F(xiàn)ACS、慢病毒感染、WB、IF、Co-IP、MS、裸鼠皮下成瘤、溶酶體結(jié)合攝取等實(shí)驗(yàn)研究MG5的腫瘤生物學(xué)功能以及相關(guān)分子機(jī)制。
　　結(jié)果：
　　一、MG5在大規(guī)模胃粘膜癌前病變?nèi)巳褐械念A(yù)警作用

3、>　　我們將陰性表達(dá)組的疾病進(jìn)展或癌變風(fēng)險設(shè)為1，相比而言，1.MG5強(qiáng)陽性（++）和極強(qiáng)陽性（+++）的胃黏膜病變的癌前進(jìn)展風(fēng)險分別是3.35和5.21。2.MG5陽性（+）和強(qiáng)陽性（++）的癌前病變進(jìn)展為胃癌的風(fēng)險分別為2.51和4.12。3.MG5陽性（+/++）時，IM/DYS病變的癌發(fā)生的風(fēng)險顯著提高（MG5+：2.71，MG5++：6.01）。4.MG5和H.pylori雙陽性或MG5單獨(dú)強(qiáng)陽性時，癌前病變組織進(jìn)展為胃癌的風(fēng)

4、險均顯著增加(MG5+, HP+:2.80；MG5++,HP+:3.48；MG5++:14.68)。以上陽性結(jié)果P值均<0.05。
　　二、MG5的表達(dá)及臨床病理學(xué)意義
　　相對于癌旁組織，MG5在人類常見的八種腫瘤中表達(dá)均顯著升高（P<0.05），包括食管鱗癌，胃腺癌，結(jié)腸腺癌，直腸腺癌，肺鱗癌，肺腺癌,乳腺導(dǎo)管癌，胰腺導(dǎo)管癌。MG5的表達(dá)在女性胃腺癌組織中顯著高于男性（P=0.028），還發(fā)現(xiàn)它在分化較差的乳腺導(dǎo)管癌中表

5、達(dá)高于分化較好的癌（P=0.003）。MG5的表達(dá)與女性胃癌患者和伴隨淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的肺癌患者的預(yù)后呈負(fù)相關(guān)，多因素回歸分析證實(shí)它是判斷這兩種患者預(yù)后的獨(dú)立指標(biāo)(P=0.015,P=0.030)。
　　三、MG5的抗原鑒定—LAM P2A
　　我們采用胃癌細(xì)胞系SGC7901開展MG5的抗原鑒定工作，WB實(shí)驗(yàn)顯示MG5分子量大約120KD，免疫沉淀(IP)結(jié)合 WB和考馬斯亮藍(lán)染色顯示MG5在120KD處明顯富集，我們在120K

6、D處進(jìn)行切膠并進(jìn)行質(zhì)譜分析(MALDI-TOF/MS),結(jié)果表明MG5很可能是LAMP2。WB結(jié)果顯示，商品化的LAMP2抗體的確可以識別MG5抗體在120KD處的IP產(chǎn)物。由于LAMP2蛋白具有 A，B，C三個亞型，我們進(jìn)一步需要確定MG5對應(yīng)的是哪一種亞型。我們在293T細(xì)胞中瞬時轉(zhuǎn)染過表達(dá)LAMP2A和LAMP2B，WB結(jié)果顯示商品化的LAMP2抗體既可以識別LAMPA，也可以識別LAMP2B，但MG5抗體只能識別LAMP2A，表

7、明MG5對應(yīng)的蛋白是LAMP2A。LAMP2A的過表達(dá)和干擾實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步證實(shí)MG5抗體識別的是LAMP2A蛋白。免疫細(xì)胞熒光實(shí)驗(yàn)表明MG5呈顆粒狀細(xì)胞器定位，并與溶酶體示蹤劑共定位于溶酶體。以上結(jié)果證實(shí)，MG5是LAMP2A。
　　四、LAM P2A在胃癌細(xì)胞增殖和生存中的作用及相關(guān)機(jī)制
　　蛋白組學(xué)篩選提示，細(xì)胞增殖調(diào)節(jié)蛋白RhoE可以和LAMP2A和HSC70結(jié)合，提示它是伴侶分子介導(dǎo)的自噬（CMA）的底物，下調(diào)LAMP2

8、A(CMA也將下調(diào))可能會上調(diào)RhoE而抑制增殖。結(jié)果證實(shí)，下調(diào)CMA的限速分子LAMP2A引起胃癌細(xì)胞的增殖減慢，同時伴有RhoE的表達(dá)增加；RhoE過表達(dá)可以直接抑制胃癌細(xì)胞的增殖；下調(diào)RhoE可以部分逆轉(zhuǎn)LAMP2A下調(diào)引起的增殖抑制。RhoE是CMA(伴侶分子介導(dǎo)的自噬)的底物。結(jié)果提示，通過下調(diào)LMAP2 A抑制CMA活性后其底物蛋白RhoE水平上調(diào)，是引起胃癌細(xì)胞增殖減慢的部分原因。我們的實(shí)驗(yàn)第一次闡明了CMA調(diào)控胃癌細(xì)胞增

9、殖的分子機(jī)制，并發(fā)現(xiàn)了一個新的CMA底物蛋白RhoE。另外，我們還研究了LAMP2A在胃癌細(xì)胞氧化應(yīng)激中的作用。發(fā)現(xiàn)下調(diào)LMAP2A抑制CMA活性后，細(xì)胞對H2O2誘導(dǎo)的凋亡更加敏感，過表達(dá)DJ-1可以保護(hù)細(xì)胞免受過多的凋亡；進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)過度氧化的DJ-1是CMA的底物蛋白，CMA障礙時，過度氧化的DJ-1不能有效降解發(fā)生積聚，部分介導(dǎo)了氧化應(yīng)激誘導(dǎo)的凋亡。提示正常的CMA可以有效清除過度氧化的DJ-1，從而維持胃癌細(xì)胞氧化應(yīng)激時的生存。