肝再生增強(qiáng)因子在胃癌中的表達(dá)及其功能研究.pdf

1、背景：胃癌是我國(guó)最常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，在我國(guó)具有發(fā)病率高、早期診斷率低、五年生存率低等特點(diǎn)。胃癌的早期癥狀多缺乏特異性，多數(shù)患者確診時(shí)已處于中、晚期，盡管手術(shù)聯(lián)合放化療具有一定療效，但胃癌患者的五年生存率仍然較低。因此，進(jìn)一步對(duì)胃癌的發(fā)病機(jī)制展開(kāi)廣泛而深入的研究，尋找有效的分子標(biāo)志物用于胃癌的早期篩查及復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移監(jiān)測(cè)，發(fā)現(xiàn)新的治療靶點(diǎn)給予針對(duì)性的治療，對(duì)于提高胃癌的早期診斷率、改善患者預(yù)后具有重要意義。
　　肝再生增強(qiáng)因子（aug

2、menter of liver regeneration,ALR）是近年來(lái)新發(fā)現(xiàn)的一種細(xì)胞因子，分布廣泛，具有促進(jìn)肝細(xì)胞DNA合成、抗肝纖維化、調(diào)節(jié)免疫、抗凋亡等作用。我們課題組在研究ALR的組織表達(dá)定位時(shí)，發(fā)現(xiàn)ALR在胃癌組織中也有表達(dá)，但有關(guān)ALR在胃癌中的生物學(xué)作用，目前國(guó)內(nèi)外還沒(méi)有相關(guān)的研究報(bào)道。因此，本實(shí)驗(yàn)主要就ALR在胃癌中的表達(dá)情況與臨床預(yù)后的相關(guān)性、外源性ALR和內(nèi)源性 ALR對(duì)人胃癌細(xì)胞株增殖和凋亡的影響展開(kāi)研究，初步

3、探討ALR在胃癌中的作用機(jī)制，為胃癌的診治及預(yù)后評(píng)估提供新的思路。
　　本研究主要分為三個(gè)部分：
　　第一部分：肝再生增強(qiáng)因子在人胃癌組織中的表達(dá)及其臨床意義
　　目的：通過(guò)研究人胃癌組織中 ALR蛋白的表達(dá)情況，分析 ALR與胃癌患者臨床指標(biāo)之間的關(guān)系，探討ALR與胃癌患者臨床預(yù)后的相關(guān)性，為下一步研究ALR在胃癌中的作用機(jī)制提供依據(jù)。
　　方法：采用Wes tern b lo t和免疫組織化學(xué)技術(shù)檢測(cè)人胃癌組

4、織和癌旁組織中 ALR蛋白的表達(dá)情況，通過(guò)統(tǒng)計(jì)學(xué)方法分析 ALR與胃癌患者臨床指標(biāo)之間的關(guān)系，以及和預(yù)后的關(guān)系。
　　結(jié)果：
　　1、7對(duì)新鮮組織和60對(duì)蠟塊組織中，胃癌組織中的ALR蛋白表達(dá)水平明顯高于癌旁組織。
　　2、ALR主要分布于胃癌細(xì)胞的細(xì)胞核和細(xì)胞漿內(nèi)；ALR在癌旁組織中不表達(dá)或極少量表達(dá)于細(xì)胞漿內(nèi)。
　　3、胃癌組織ALR的高表達(dá)與是否合并淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、T NM分期、是否侵及漿膜層和分化程度相關(guān)。<

5、br>　　4、ALR陽(yáng)性胃癌患者的生存中位數(shù)（23.000月）小于 ALR陰性胃癌患者的生存中位數(shù)（46.000月）。
　　5、Co x回歸分析顯示胃癌組織中ALR蛋白是否表達(dá)、T NM分期和術(shù)后是否化療是影響胃癌患者生存的獨(dú)立預(yù)后因素。
　　結(jié)論：ALR在胃癌組織中高表達(dá)， A LR可能在胃癌的侵潤(rùn)、轉(zhuǎn)移過(guò)程中發(fā)揮了一定作用， A LR有望成為胃癌的輔助診斷指標(biāo)和判斷胃癌患者預(yù)后的指標(biāo)。
　　第二部分：外源性肝再生增

6、強(qiáng)因子對(duì)人胃癌細(xì)胞株增殖和凋亡的影響
　　目的：研究外源性肝再生增強(qiáng)因子對(duì)人胃癌細(xì)胞株增殖和凋亡的影響，以初步探討外源性肝再生增強(qiáng)因子在人胃癌細(xì)胞中的生物學(xué)作用及可能的機(jī)制。
　　方法：采用MTS法、流式細(xì)胞術(shù)和Wes tern b lo t研究外源性ALR對(duì)人胃癌細(xì)胞株增殖和凋亡的影響；采用MTS法、流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)外源性ALR對(duì)化療藥物順鉑誘導(dǎo)的胃癌細(xì)胞凋亡的作用，用Wes tern b lo t法檢測(cè)凋亡相關(guān)蛋白的變化。

7、
　　結(jié)果：
　　1、外源性 ALR對(duì)人胃癌細(xì)胞株 MKN-45、BG C-823、S GC-7901、MKN-28有促增殖的作用，該作用呈劑量依賴性。
　　2、外源性ALR可以拮抗化療藥物順鉑對(duì)胃癌細(xì)胞MKN-45的抑制作用。
　　3、外源性ALR對(duì)人胃癌細(xì)胞MKN-45的凋亡沒(méi)有影響，但能減少順鉑誘導(dǎo)的MKN-45細(xì)胞凋亡，該作用呈劑量依賴性。
　　4、加入順鉑再加入外源性ALR，隨著ALR濃度的增加可

8、以下調(diào)Bax的表達(dá)，上調(diào)Pro-PARP、Pro-caspase8、Pro-caspase9、Pro-caspase3和Bc l-2的表達(dá)水平及Bc l-2/B ax比率。
　　結(jié)論：
　　1、外源性 ALR能夠促進(jìn)人胃癌細(xì)胞的增殖、可以通過(guò)減少凋亡拮抗順鉑引起的細(xì)胞抑制。
　　2、外源性 ALR對(duì)胃癌細(xì)胞 MKN-45的抗凋亡作用需要損傷因素的激活。
　　3、外源性ALR通過(guò)下調(diào)Bax的表達(dá)，上調(diào)Pro-PAR

9、P、Pro-caspase8、P ro-c asp as e9、P ro-c asp as e3的表達(dá)及Bc l-2/Ba x比率來(lái)發(fā)揮抗凋亡作用。
　　第三部分：下調(diào)內(nèi)源性肝再生增強(qiáng)因子的表達(dá)對(duì)人胃癌細(xì)胞株生物學(xué)特征的影響
　　目的：觀察下調(diào)內(nèi)源性ALR的表達(dá)對(duì)人胃癌細(xì)胞株增殖、凋亡和遷移侵襲等生物學(xué)行為的影響，進(jìn)一步研究?jī)?nèi)源性ALR在胃癌中的作用，為胃癌的分子靶向治療提供新的思路。
　　方法：用ALR s hR N

10、Ai慢病毒載體轉(zhuǎn)染胃癌細(xì)胞，建立下調(diào)ALR表達(dá)的胃癌細(xì)胞穩(wěn)定株及空病毒對(duì)照細(xì)胞株，用Wes tern b lo t和RT-P CR法驗(yàn)證干擾效果；用MTS、流式細(xì)胞術(shù)、平板克隆實(shí)驗(yàn)、Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)、劃痕實(shí)驗(yàn)、裸鼠皮下成瘤實(shí)驗(yàn)來(lái)觀察下調(diào)ALR表達(dá)對(duì)MKN-45細(xì)胞增殖、凋亡和遷移侵襲等方面的影響；用Wes tern b lo t實(shí)驗(yàn)檢測(cè)凋亡相關(guān)蛋白的變化。
　　結(jié)果：
　　1、人胃癌細(xì)胞株 MKN-45(低分化)、

11、BGC-823(低分化)、S GC-7901(中分化)中的 ALR蛋白表達(dá)水平顯著高于人胃癌細(xì)胞株MK N-28(高分化)和正常胃粘膜上皮細(xì)胞G ES-1。
　　2、成功將ALR s hR NAi慢病毒轉(zhuǎn)染MKN-45細(xì)胞，轉(zhuǎn)染后MKN-45細(xì)胞的ALR蛋白和mR NA表達(dá)水平均明顯下調(diào)。
　　3、下調(diào)ALR的表達(dá)能夠抑制胃癌細(xì)胞MKN-45的增殖。
　　4、下調(diào)ALR的表達(dá)降低MKN-45細(xì)胞的克隆形成能力。

12、　　5、下調(diào)ALR的表達(dá)降低MKN-45細(xì)胞的侵襲能力。
　　6、下調(diào)ALR的表達(dá)降低MKN-45細(xì)胞的遷移能力。
　　7、下調(diào) ALR的表達(dá)降低胃癌細(xì)胞 MKN-45在裸鼠皮下的成瘤能力。
　　8、下調(diào)ALR的表達(dá)增加MKN-45細(xì)胞對(duì)順鉑的化療敏感性。
　　9、下調(diào) ALR的表達(dá)增加 MKN-45細(xì)胞的凋亡，使順鉑誘導(dǎo)的MK N-45細(xì)胞凋亡更加顯著。
　　10、下調(diào) ALR的表達(dá)可以上調(diào) Bax的表達(dá)

13、、下調(diào) Pro-PARP、Pro-caspase8、Pro-caspase9、Pro-caspase3、Bcl-2和Bcl-2/Bax比率，并且使順鉑誘導(dǎo)凋亡的 MKN-45細(xì)胞的凋亡蛋白 Bax的上調(diào)，及Pro-PARP、Pro-caspase8、Pro-caspase9、Pro-caspase3、Bcl-2和Bc l-2/Ba x比率的下調(diào)更加顯著。
　　結(jié)論：
　　1、內(nèi)源性 ALR在人胃癌細(xì)胞中的表達(dá)水平與細(xì)胞的分化

14、程度相關(guān)。
　　2、內(nèi)源性ALR可促進(jìn)胃癌細(xì)胞MKN-45的增殖、抑制凋亡、增強(qiáng)細(xì)胞的遷移侵襲能力。
　　3、內(nèi)源性 ALR對(duì)化療藥物順鉑誘導(dǎo)的胃癌細(xì)胞 MKN-45的凋亡有保護(hù)作用，下調(diào)ALR表達(dá)能與順鉑起協(xié)同作用，增加細(xì)胞凋亡，增強(qiáng)化療藥物敏感性。
　　4、下調(diào) ALR的表達(dá)增加細(xì)胞凋亡和增強(qiáng)化療藥物敏感性的主要機(jī)制為上調(diào)Bax的表達(dá)，及下調(diào)Pro-PARP、Pro-caspase8、Pro-caspase9、P