人肝再生增強(qiáng)因子結(jié)合肽的篩選、表達(dá)及功能研究.pdf

1、目的：人肝再生增強(qiáng)因子(human augmenter of liver regeneration，hALR)是肝臟再生過(guò)程中的一個(gè)重要調(diào)控因子，在肝損傷修復(fù)過(guò)程中發(fā)揮重要作用，但有關(guān)它在肝再生過(guò)程中的分子生物學(xué)機(jī)制尚未完全明確。本研究擬從人QGY肝癌細(xì)胞cDNA文庫(kù)中篩選出可能與hALR發(fā)生相互作用的蛋白質(zhì)，并對(duì)之進(jìn)行鑒定、克隆和生物學(xué)功能的初步研究，將有助于闡明hALR的信號(hào)傳導(dǎo)機(jī)制，進(jìn)而為闡明肝臟損傷與再生的分子生物學(xué)機(jī)制提供理論

2、基礎(chǔ)。 方法： 1．hALR結(jié)合肽的篩選以hALR為靶蛋白，從人肝癌細(xì)胞cDNA噬菌體展示文庫(kù)中篩選與hALR相互作用的特異噬菌體克隆；對(duì)獲得的特異噬菌體克隆進(jìn)行PCR及ELISA鑒定，并對(duì)獲得的cDNA插入片段進(jìn)行測(cè)序和生物信息學(xué)分析；利用<'3>H-TdR摻入法測(cè)定hALR聯(lián)合陽(yáng)性噬菌體克隆對(duì)QGY肝癌細(xì)胞株的增殖效應(yīng)。 2．用RNA干擾技術(shù)研究hALR與citron kinase的相互關(guān)系采用細(xì)胞免疫化學(xué)、

3、共聚焦顯微鏡及RT-PCR方法檢測(cè)QGY細(xì)胞胞中citron kinase的表達(dá)情況及與hALR的關(guān)系；設(shè)計(jì)并合成了三條針對(duì)citron kinase不同靶位的siRNA片段，用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法瞬時(shí)轉(zhuǎn)染細(xì)胞后48h，分別用real-time RT-PCR法檢測(cè)citron kinase的mRNA水平變化，western blot法檢測(cè)citron kinase蛋白水平的變化以及用細(xì)胞免疫化學(xué)、共聚焦顯微鏡觀察QGY細(xì)胞中citron kin

4、ase表達(dá)變化的情況；利用<'3>H-TdR摻入法檢測(cè)RNA干擾48h后，hALR刺激QGY細(xì)胞的增殖情況。 3．GST-hALRIP融合蛋白的構(gòu)建、表達(dá)及功能研究用PCR法從與hALR具有相互作用的特異噬菌體cDNA克隆中擴(kuò)增出hALR相互作用肽(hALRIP)的DNA片段，并將其亞克隆入質(zhì)粒pGEX-4T-2中；重組質(zhì)粒pGEX-4T-2-hALRIP被轉(zhuǎn)化入宿主菌BL21(DE3)中，在IPTG誘導(dǎo)下進(jìn)行表達(dá)；表達(dá)產(chǎn)物GS

5、T-hALRIP融合蛋白采用Glutathione Sepharose 4B親合層析法純化；用pull-down實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證GST-hALRIP融合蛋白與hALR在體外的相互作用；采用<'3>H-TdR摻入法檢測(cè)GST-hALRIP融合蛋白對(duì)hALR刺激QGY細(xì)胞增殖活性的影響。 結(jié)果： 1．hALR結(jié)合肽的篩選 (1)人肝癌細(xì)胞cDNA噬菌體表面展示文庫(kù)經(jīng)過(guò)四輪篩選后，噬菌體的富集效果(即噬菌體的產(chǎn)率)從2.9×1

6、0<'3>上升到了9.0×10<'-1>，表明特異性結(jié)合噬菌體得到了明顯富集。 (2)通過(guò)ELISA方法檢測(cè)所篩選到的陽(yáng)性噬菌體克隆在不同稀釋度時(shí)與包被在酶標(biāo)板上的hALR的結(jié)合性，結(jié)果顯示，在包被了hALR的孔中，A495nm吸光值隨著噬菌體數(shù)量的增加而增加，說(shuō)明所篩選到的陽(yáng)性噬菌體克隆與hALR的結(jié)合是特異的，且呈劑量依賴(lài)關(guān)系。 (3)對(duì)四輪篩選后得到的噬菌體克隆進(jìn)行PCR擴(kuò)增，均擴(kuò)增出約300bp的cDNA插入片段

7、，測(cè)序結(jié)果顯示序列完全一致，表明通過(guò)四輪篩選后與hALR有相近親和力的特異性噬菌體得到大量富集。 (4)將所獲得的hALR相互作用肽(hALRIP)序列信息在NCBI的EST數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行同源性比較，發(fā)現(xiàn)與人citron kinase mRNA部分序列同源性達(dá)100％。根據(jù)跨膜蛋白預(yù)測(cè)分析軟件分析，hALRIP序列位于citron kinase開(kāi)放閱讀框架(ORF)N端第1846～2057位堿基之間，即598～668氨基酸位置，不

8、在citron kinase的跨膜區(qū)位置。 (5)將不同滴度四篩后噬菌體液與hALR混合后同時(shí)作用于QGY細(xì)胞，觀察到顯著促增殖效應(yīng)，且明顯高于單獨(dú)的hALR組(F=29.28，p<0.01)；而混合hALR的不同滴度的對(duì)照噬菌體組與單獨(dú)的hALR組間比較無(wú)顯著性差異(F=0.638，p>0.05)，提示篩庫(kù)獲得的陽(yáng)性噬菌體展示肽與hALR之間有協(xié)同效應(yīng)。 2．用RNA干擾技術(shù)研究hALR與citron kinase的相

9、互關(guān)系 (1)RT-PCR結(jié)果顯示人肝癌細(xì)胞QGY中有citron kinase表達(dá)；細(xì)胞免疫化學(xué)、共聚焦顯微鏡觀察顯示citron kinase主要分布在QGY細(xì)胞的胞漿和胞核中，在細(xì)胞分裂期則位于分裂溝及中間體位置；并且QGY細(xì)胞經(jīng)hALR刺激后，citron kinase的表達(dá)量明顯增加，說(shuō)明hALR能促進(jìn)QGY細(xì)胞中citron kinase的表達(dá)，兩者之間存在著相關(guān)性。 (2)成功構(gòu)建和合成了三條針對(duì)citro

10、n kinase基因上不同靶位點(diǎn)的siRNA片段，其中靶序列1和2是針對(duì)hALRIP序列，并成功轉(zhuǎn)染QGY細(xì)胞；real-time RT-PCR結(jié)果顯示轉(zhuǎn)染48h后三條siRNA片段均能有效抑制citron kinase基因的表達(dá)，mRNA的表達(dá)水平分別只相當(dāng)于抑制前的37.89％、22.69％和26.61％，再一次證明hALRIP片段為citronkinase上的一段；western blot和激光共聚焦顯微鏡結(jié)果顯示三條siRNA均

11、能有效抑制citron kinase蛋白的表達(dá)，與抑制citron kinase的mRNA表達(dá)程度相符，表明siRNA抑制mRNA水平和抑制蛋白表達(dá)的程度顯著相關(guān)。 (3)<'3>H-TdR摻入法測(cè)定轉(zhuǎn)染siRNA片段48h后，hALR刺激QGY細(xì)胞增殖的cpm值分別為4639±382、3060±201和3576±425，與轉(zhuǎn)染陰性對(duì)照組(7007±156)和空白組(7566±1009)相比，有顯著性差異(p<0.05)，其中

12、siRNA2抑制作用最明顯，但三組間無(wú)顯著性差異，表明hALR刺激QGY細(xì)胞增殖是通過(guò)citron kinase發(fā)揮作用的，citron kinase是hALR的下游因子，只要阻斷citron kinase的表達(dá)就能阻斷hALR的促增殖作用。 3．GST-hALRIP融合蛋白的構(gòu)建、表達(dá)及功能研究 (1)成功構(gòu)建了hALRIP的重組質(zhì)粒pGEX-4T-2-hALRIP，并經(jīng)酶切、PCR和測(cè)序鑒定完全正確。 (2)

13、重組質(zhì)粒pGEX-4T-2-hALRIP在宿主菌BL21(DE3)中得到高效表達(dá)，GST-hALRIP融合蛋白分子量約為33 kd，與預(yù)計(jì)理論值相符合；表達(dá)的目的蛋白主要存在于包涵體內(nèi)，部分存在于細(xì)菌破碎上清中；通過(guò)Glutathione Sepharose 4B親合純化得到的目的蛋白經(jīng)SDS-PAGE鑒定為單一條帶，蛋白定量為103.2μg/ml。 (3)pull-down實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示GST-hALRIP融合蛋白與hALR蛋白

14、之間有結(jié)合作用，而GST與hALR蛋白之間沒(méi)有結(jié)合作用，表明hALRIP蛋白與hALR之間在體外存在有相互結(jié)合作用。 (4)<'3>H-TdR摻入法檢測(cè)GST-hALRIP融合蛋白對(duì)hALR刺激QGY細(xì)胞增殖活性的影響結(jié)果顯示，GST-hALRIP融合蛋白和空載體表達(dá)的融合蛋白在高濃度時(shí)均能顯著抑制hALR的促Q(mào)GY細(xì)胞增殖效應(yīng)(p<0.05)，并且兩者之間無(wú)差異(p>0.05)，結(jié)果未能反映出GST-hALRIP融合蛋白與hA

15、LR結(jié)合的特異性。 結(jié)論： 1．從人肝癌細(xì)胞cDNA噬菌體表面展示文庫(kù)中成功篩選出hALR結(jié)合肽hALRIP。 2．證實(shí)hALRIP片段為citron kinase上的一段。 3．QGY細(xì)胞中有citron kinase的表達(dá)，hALR能促進(jìn)citron kinase的表達(dá)。 4．成功構(gòu)建和合成citron kinase的siRNA片段，并能有效抑制QGY細(xì)胞中citron kinase基因的表達(dá)