肝再生增強因子在細胞線粒體氧化應(yīng)激損傷中的作用研究.pdf

1、第一部分：下調(diào)肝再生增強因子對H2O2誘導(dǎo)的細胞線粒體氧化應(yīng)激損傷的影響
　　目的：觀察ALR是否參與了細胞氧化應(yīng)激的病理過程，并探究下調(diào)ALR表達對H2O2誘導(dǎo)腎小管上皮細胞線粒體氧化應(yīng)激損傷的影響。
　　方法：采用H2O2誘導(dǎo)腎小管上皮細胞氧化應(yīng)激損傷，實時熒光定量PCR及Western blot檢測細胞ALR表達情況。設(shè)計特異性小干擾RNA（siRNA）下調(diào)HK-2細胞ALR表達，以siRNA/control對照組，實

2、時熒光定量PCR、Western blot及免疫熒光驗證ALR干擾效果，MTS檢測細胞增殖能力。H2O2刺激12h后，流式細胞儀檢測細胞活性氧（ROS）水平、線粒體膜電位變化及細胞凋亡情況；Western blot檢測凋亡蛋白Bcl-2/Bax表達水平及線粒體蛋白（Cyt C、Smac）釋放；激光共聚焦檢測Cyt C釋放。
　　結(jié)果：實時熒光定量PCR及Western blot檢測顯示，與siRNA/control對照組比較，H2

3、O2刺激組細胞內(nèi)源性23kDALR mRNA及蛋白表達顯著增加(P<0.05)。MTS結(jié)果顯示，下調(diào)23kD ALR表達對HK-2細胞增殖無明顯影響(P>0.05)，但加重了H2O2誘導(dǎo)的細胞氧化應(yīng)激損傷。與siRNA/control組相比，細胞ROS水平顯著增加，膜電位降低細胞比例明顯增加，促進了H2O2誘導(dǎo)的細胞凋亡蛋白表達及線粒體凋亡相關(guān)蛋白釋放，增加了H2O2誘導(dǎo)的細胞凋亡水平，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。
　　結(jié)

4、論：23kD ALR參與了H2O2誘導(dǎo)的HK-2細胞氧化應(yīng)激損傷。下調(diào)23kD ALR表達可加重H2O2誘導(dǎo)的HK-2細胞線粒體氧化應(yīng)激損傷。
　　第二部分：23kD肝再生增強因子表達質(zhì)粒構(gòu)建及功能研究
　　目的：探究過表達23kD肝再生增強因子對人正常肝細胞（L-02）增殖及凋亡的影響。
　　方法：構(gòu)建23kD ALR重組表達質(zhì)粒 pcDNA6/23kDALR。以MegaTran1.0轉(zhuǎn)染試劑轉(zhuǎn)染至L-02細胞，實時

5、熒光定量PCR及Western blot檢測細胞ALR mRNA及蛋白水平表達情況，MTS檢測細胞增殖能力，流式細胞儀檢測H2O2誘導(dǎo)的細胞凋亡變化。
　　結(jié)果：成功構(gòu)建pcDNA6/23kDALR表達質(zhì)粒。實時熒光定量PCR及Western blot檢測顯示，與空質(zhì)粒對照組比較，L-02細胞過表達組23kD ALR表達顯著增加（ P<0.01）;與空質(zhì)粒對照組相比， pcDNA6/23kD ALR質(zhì)粒轉(zhuǎn)染48h及72h細胞增殖顯