人肝再生增強(qiáng)子的克隆、表達(dá)及其在肝衰竭患者中表達(dá)水平的研究.pdf

1、研究背景：
　　在我國(guó)，病毒性肝炎尤其是慢性乙型肝炎感染率及發(fā)病率高，肝衰竭成為慢性肝病患者的主要死亡原因之一。肝衰竭的發(fā)生、發(fā)展及預(yù)后的差異性與肝細(xì)胞的凋亡及再生相關(guān)，一系列的復(fù)雜因素包括大量肝細(xì)胞壞死、凋亡及退化參與其中。肝再生是一個(gè)十分復(fù)雜的過程，一系列細(xì)胞因子包括肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子、表皮生長(zhǎng)因子、轉(zhuǎn)移生長(zhǎng)因子及胰島素等。但上述細(xì)胞因子均無法解釋器官特異性肝細(xì)胞再生。人肝再生增強(qiáng)因子(hALR)是最新發(fā)現(xiàn)的一種與肝再生密切相關(guān)的

2、細(xì)胞因子，研究表明hALR是目前已知唯一對(duì)肝源性細(xì)胞有特異性增殖刺激活性的因子，能顯著促進(jìn)肝細(xì)胞再生。在非激活狀態(tài)下ALR在肝細(xì)胞中低水平持續(xù)表達(dá)，而當(dāng)肝細(xì)胞收到損傷肝再生過程啟動(dòng)時(shí)，ALR表達(dá)量大大增加并從肝細(xì)胞內(nèi)釋放入血。有動(dòng)物實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)在肝再生早期外周血ALR水平即有明顯上升且較其它肝再生相關(guān)的細(xì)胞因子早，血清ALR水平良好反映肝臟ALR表達(dá)水平及肝臟再生情況。本研究通過重組克隆制備獲得高純度hALR蛋白及抗hALR單克隆抗體，通過

3、免疫組化、定量PCR及ELISA等方法比較不同類型及不同預(yù)后慢性肝病（包括肝衰竭、肝癌、慢性乙型肝炎等）患者肝組織hALR分布、mRNA表達(dá)水平及血清hALR表達(dá)水平差異，以及同一肝衰竭患者不同疾病發(fā)展階段hALR水平變化，進(jìn)一步闡明hALR在肝細(xì)胞再生中的可能作用機(jī)制，探討hALR在肝衰竭發(fā)生、發(fā)展及轉(zhuǎn)歸中的地位及意義。
　　方法：
　　以肝移植正常人供肝總mRNA為模板，以RT-PCR獲取全長(zhǎng)hALR cDNA，構(gòu)建合成

4、蛋白標(biāo)簽、蛋白酶切位點(diǎn)及分泌信號(hào)肽序列，然后將hALR、蛋白標(biāo)簽、蛋白酶切位點(diǎn)及原核表達(dá)用分泌信號(hào)肽以一定的連接順序同時(shí)克隆到E.coli表達(dá)載體pET28a(+)中，轉(zhuǎn)化E.coli BL21，制備工程菌，摸索誘導(dǎo)表達(dá)條件，避免形成大量包涵體，使hALR以分泌蛋白的形式在大腸桿菌中得以高表達(dá)，然后利用陰離子交換層析、陽離子交換層析和分子篩等技術(shù)，純化重組hALR，使制備的重組hALR純度在98％以上。通過聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-P

5、AGE)和免疫印跡(Western-Blot)等方法，利用重組蛋白上帶有的蛋白標(biāo)簽，鑒定特異性目的蛋白的表達(dá)。用相應(yīng)的蛋白酶切去蛋白重組多肽后獲取天然結(jié)構(gòu)hALR蛋白，利用免疫共沉淀和質(zhì)譜技術(shù)，對(duì)重組hALR的分子量、等電點(diǎn)等生物學(xué)性狀進(jìn)行鑒定。
　　以hALR蛋白為抗原腹腔注射免疫Balb/c小鼠，以Balb/c小鼠腹腔巨噬細(xì)胞作為滋養(yǎng)細(xì)胞，將小鼠脾細(xì)胞與SP2/O細(xì)胞混合接種，采用間接ELISA篩選分泌抗hALR抗體的陽性雜交

6、瘤細(xì)胞株，將雜家瘤細(xì)胞腹腔接種于腹水小鼠，抽取腹水-20C保存。用hALR蛋白以westem-blot的方法鑒定與單克隆抗體的特異性結(jié)合。以不同細(xì)胞因子包被進(jìn)行間接ELISA檢測(cè)，排除單克隆抗體的交叉反應(yīng)。
　　入選臨床病例，獲得知情同意后用肝穿刺活檢的方法獲取肝組織，部分接受原位肝移植的肝衰竭患者可獲取其肝組織分切成小塊，固定后臘塊包埋保存，部分凍存于液氮罐。同時(shí)在其疾病的第1、3、7、14及21天抽取外周血，離心后將上清分別凍

7、存于-20C。將hALR蛋白稀釋成一系列濃度，與hALR單克隆抗體以Elisa方法制作hALR濃度與吸光值的標(biāo)準(zhǔn)曲線，參照標(biāo)準(zhǔn)曲線，以ELISA的方法檢測(cè)外周血hALR水平，將臘塊包埋的肝組織切片，常規(guī)制片后脫蠟，羊血清封閉，一抗為抗hALR抗體，二抗為HRP標(biāo)記兔抗鼠IgG，DAB顯色，蘇木素復(fù)染，顯微鏡下觀察并拍照，同時(shí)設(shè)立陰性對(duì)照制片，觀察hALR在肝組織內(nèi)分布情況。用real-time PCR的方法檢測(cè)肝組織內(nèi)ALRmRNA表達(dá)

8、水平，β-actinmRNA水平被用來衡量不同批次mRNA的cDNA合成及逆轉(zhuǎn)錄效率。
　　結(jié)果：
　　獲取全長(zhǎng)375kb的ALR cDNA并成功克隆于pET-28a(+)，表達(dá)、純化、鑒定hALR蛋白，純化的ALR質(zhì)譜法檢測(cè)ALR分子量24.712KD，等電點(diǎn)為4.63，并成功獲取抗hALR單克隆抗體。定量PCR結(jié)果顯示ALR mRNA在肝癌組織中高表達(dá)(10E6.24(1.74×106) copies/μl），在肝衰竭惡

9、化接受肝移植組低表達(dá)(10E3.45(2.82×103) copies/μl），在正常人肝組織中低表達(dá)(10E4.31(2.04×104)copies/μl)。Elisa研究血清ALR表達(dá)水平結(jié)果顯示:血清ALR水平肝衰竭肝功能好轉(zhuǎn)組(1613.5±369.6 pmol/ml)顯著高于肝衰竭肝功能惡化組(462.3±235.8pmol/ml).原發(fā)性肝癌組(917.9±332.7 pmol/ml)、慢性乙型肝炎組(969.2±332.5