胃癌相關(guān)抗原MG7-Ag的鑒定和功能分析.pdf

1、胃癌是最常見的惡性腫瘤之一，其死亡率居腫瘤的第二位。對(duì)胃癌的早期診斷和治療是胃癌研究的重大課題。胃癌早期無明顯癥狀，發(fā)現(xiàn)時(shí)已到晚期，預(yù)后極差。以往的胃癌標(biāo)志物如CEA、CA50等對(duì)胃癌的敏感性和特異性較低，早期診斷受到限制。因此，尋找新的組織學(xué)、細(xì)胞學(xué)、血清學(xué)的胃癌新抗原，對(duì)胃癌診治的意義重大。
　　本實(shí)驗(yàn)室樊代明教授在上世紀(jì)八十年代研制出一系列胃癌單克隆抗體，命名為MG系列。其中，MG7-Ag對(duì)胃癌的敏感性特異性都很高。后續(xù)本實(shí)

2、驗(yàn)室及國(guó)內(nèi)醫(yī)學(xué)專家對(duì)此進(jìn)行了一系列相關(guān)深入的研究，包括胃癌單克隆抗體MG7對(duì)胃癌的診斷、評(píng)價(jià)預(yù)后及動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)作用、MG7靶向治療作用、特異性納米疫苗的制備等等，在國(guó)內(nèi)外發(fā)表了幾十篇很有影響力的文章。
　　但是，MG7-Ag尚未可知，MG7單抗在國(guó)際上的推廣及進(jìn)一步研究受到限制。香港科技大學(xué)學(xué)者鑒定MG7-Ag為hnRNPA2?B1，但是其性質(zhì)與我們的以往研究的MG7-Ag不符。本研究使用免疫沉淀、雙向電泳、質(zhì)譜分析等技術(shù)鑒定MG7-

3、Ag，對(duì)于發(fā)現(xiàn)新的癌抗原或癌蛋白，對(duì)于胃癌新的分子機(jī)制的研究有著不可估量的重要意義。
　　此外，本研究擬建立一個(gè)簡(jiǎn)便的胃癌血清學(xué)早期診斷方法，用于胃癌高危人群的普查。MG7單抗對(duì)胃癌細(xì)胞凋亡作用的研究，為今后的臨床藥物治療提供新的思路。
　　總之，本項(xiàng)研究有深刻的理論意義和臨床應(yīng)用前景。
　　【目的】
　　1、免疫組織化學(xué)檢測(cè)MG7-Ag在胃粘膜組織中的表達(dá)與分布特點(diǎn)及與臨床特征的聯(lián)系；2、研究MG7-Ag與hn

4、RNPA2/B1的表達(dá)區(qū)別；3、MG7-Ag的鑒定；4、建立檢測(cè)MG7-Ag的簡(jiǎn)便的胃癌血清學(xué)早期診斷方法；5、MG7單抗對(duì)胃癌細(xì)胞凋亡及細(xì)胞周期的影響。
　　【方法】
　　1、通過細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)復(fù)蘇MG7雜交瘤細(xì)胞，制備MG7單抗；2、應(yīng)用免疫組化技術(shù)檢測(cè)MG7-Ag在胃粘膜組織中的表達(dá)與分布特點(diǎn)及與臨床特征的聯(lián)系；3、應(yīng)用免疫組化技術(shù)觀察MG7-Ag與hnRNPA2/B1在胃癌組織中的表達(dá)區(qū)別；4、應(yīng)用免疫細(xì)胞化學(xué)技術(shù)和掃

5、描共聚焦顯微鏡觀察MG7-Ag與hnRNPA2/B1在胃癌細(xì)胞中的表達(dá)區(qū)別；5、通過Westernblot技術(shù)檢測(cè)MG7-Ag與hnRNPA2/B1胃癌細(xì)胞中的表達(dá)區(qū)別；6、應(yīng)用免疫沉淀，Westernblot，雙向電泳，質(zhì)譜技術(shù)鑒定MG7-Ag；7、通過酶聯(lián)免疫吸附方法建立檢測(cè)MG7-Ag的胃癌血清學(xué)早期診斷方法；8、通過MG7-Ag的胃癌血清學(xué)早期診斷方法檢測(cè)胃癌，胃癌前病變和其它各種腫瘤病人；9、流式細(xì)胞儀檢測(cè)MG7抗體對(duì)胃癌細(xì)胞

6、凋亡和細(xì)胞周期的影響。
　　【結(jié)果】
　　1、MG7-Ag在胃粘膜組織中的表達(dá)與分布及與臨床特征的聯(lián)系
　　檢測(cè)了MG7-Ag在胃粘膜組織（胃癌116例；淺表性胃炎，腸化，增生、萎縮性胃炎等84例）石蠟組織標(biāo)本中的表達(dá)與分布情況，發(fā)現(xiàn)MG7-Ag陽性表達(dá)率是隨著淺表性胃炎，腸化，增生，胃癌，逐漸增高的。MG7-Ag陽性分布：1.腺上皮細(xì)胞的胞漿上極和胞膜；2.胃腺腔內(nèi)。胃癌旁切片染色提示：胃黏膜腺體底部上皮細(xì)胞MG7-

7、Ag幾乎全部陽性，向頂端方向陽性細(xì)胞漸減少，而頂端腔面上皮細(xì)胞MG7-Ag又多為陽性。在胃癌患者中，MG7-Ag表達(dá)與年齡、性別無關(guān)，與分化和臨床分期有關(guān)。
　　2、MG7-Ag與hnRNPA2/B1在胃癌細(xì)胞中表達(dá)存在明顯區(qū)別
　　我們應(yīng)用免疫組化技術(shù)檢測(cè)同一胃癌石蠟切塊中MG7-Ag與hnRNPA2/B1在胃癌細(xì)胞中的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)MG7-Ag主要分布在細(xì)胞膜，細(xì)胞核中未見陽性表達(dá)，而hnRNPA2/B1主要分布在細(xì)胞核中。

8、應(yīng)用免疫細(xì)胞化學(xué)技術(shù)和掃描共聚焦觀察MG7-Ag與hnRNPA2/B1在胃癌細(xì)胞SGC7901，MKN45中的表達(dá)區(qū)別，發(fā)現(xiàn)MG7-Ag主要分布在細(xì)胞膜上，細(xì)胞核中未見陽性表達(dá)，而hnRNPA2/B1主要分布在細(xì)胞核中。通過Westernblot技術(shù)檢測(cè)MG7-Ag與hnRNPA2/B1在胃癌細(xì)胞MKN45中的區(qū)別，MG7-Ag表現(xiàn)為2條帶，分子量分別約100KD、120KD；hnRNPA2/B1表現(xiàn)為2條帶，分子量分別約34KD、37

9、KD。
　　3、MG7-Ag的鑒定
　　我們通過免疫沉淀方法，將MG7抗體分別與胃癌細(xì)胞系SGC7901，MKN45，胃癌組織交聯(lián)，行單向或雙向電泳。與Westernblot相匹配的蛋白點(diǎn)從銀染或考馬斯亮藍(lán)染色的膠中切下，轉(zhuǎn)到離心管中做質(zhì)譜檢測(cè)。
　　免疫沉淀的單向電泳，銀染的表觀分子量為100KD的胃癌組織條帶和胃癌細(xì)胞系MKN45條帶，LC-MS/MS分析鑒定最可能為anti-colorectalcarcinoma

10、heavychain；考馬斯亮藍(lán)染色的表觀分子量為100KD的胃癌細(xì)胞系MKN45條帶和SGC7901條帶，ESI-MS/MS分析鑒定最可能為anti-humanCD19monoclonalantibody4G7immunoglobulingamma1heavychain。
　　免疫沉淀的雙向電泳，考馬斯亮藍(lán)染色的表觀分子量為100KD的胃癌組織條帶，MALDI-TOF/TOF分析鑒定為IGHG3protein。通過Western

11、blot技術(shù)，抗人IgG抗體可以與MG7-Ag結(jié)合，說明MG7-Ag可能為免疫球蛋白重鏈樣分子。
　　4、研發(fā)檢測(cè)MG7-Ag的胃癌血清學(xué)早期診斷方法及應(yīng)用
　　應(yīng)用間接酶聯(lián)免疫吸附方法，生物素-親和素放大系統(tǒng)，選擇合適的包被條件和抗體濃度，檢測(cè)胃癌手術(shù)前后，胃癌前病變和其他腫瘤患者的血清中MG7-Ag。PBS（0.01M）為陰性對(duì)照。大于陰性對(duì)照的A值的2.1倍為陽性。116例胃癌術(shù)前患者的陽性率為83.6％，明顯高于胃癌

12、術(shù)后（總63例，47.6％），胃癌前病變（總78例，12.8％）和其它腫瘤組。統(tǒng)計(jì)學(xué)分析差別有顯著意義（P<0.01）。MG7-Ag在其他腫瘤患者血清中也有不同程度的陽性表達(dá)，如肺癌（45.2％），直腸癌（45.5％），結(jié)腸癌（17.6％），乳腺癌（14.2％），而子宮癌，淋巴瘤，急性白血病患者中未檢測(cè)出。胃癌術(shù)前患者血清檢測(cè)MG7-Ag的的陽性表達(dá)率隨著TNM分期進(jìn)展逐漸升高：Ⅰ期（總6例，33.3％），Ⅱ期（總46例，78.3％），

13、Ⅲ期（總62例，91.9％），Ⅳ期（總2例，100％），統(tǒng)計(jì)學(xué)顯示各組間差別有顯著意義（P<0.01）；N0（總30例，60.0％），≥N1（總86例，91.9％），統(tǒng)計(jì)學(xué)顯示差別有顯著意義（P<0.01）。以上結(jié)果提示，MG7-Ag是胃癌較特異性的標(biāo)志，MG7-Ag的表達(dá)率隨胃癌的進(jìn)展而升高。間接酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)檢測(cè)患者血清MG7-Ag可以作為胃癌的早期診斷的簡(jiǎn)便方法。
　　5、MG7單抗對(duì)胃癌細(xì)胞凋亡及細(xì)胞周期的影響。

14、　　應(yīng)用流式細(xì)胞儀檢測(cè)MG7單抗對(duì)胃癌細(xì)胞系KATOⅢ的凋亡影響，發(fā)現(xiàn)MG7單抗明顯促進(jìn)胃癌細(xì)胞的早期凋亡(P<0.05)。細(xì)胞周期檢測(cè)，MG7單抗主要使胃癌細(xì)胞阻滯在G1期。
　　【結(jié)論】
　　本研究提示：MG7-Ag的表達(dá)水平與胃癌的分期和惡性程度相關(guān)，可能在胃癌的發(fā)生和進(jìn)展中起重要的作用；MG7-Ag與hnRNPA2/B1在胃癌細(xì)胞表達(dá)中存在明顯區(qū)別，MG7-Ag是hnRNPA2/B1的可能性不大；MG7-Ag可能為免