不同倍性鯽鯉性腺發(fā)育相關(guān)基因和miRNAs的鑒定及功能分析.pdf

1、多倍體化是物種進(jìn)化的重要特征。遠(yuǎn)緣雜交是將一個(gè)物種的基因組轉(zhuǎn)移到另一個(gè)物種中的有效方法，從而使得雜交后代在表型上顯示出雜種優(yōu)勢以及在基因型上形成多倍體。在紅鯽(Carassius auratusred var.，RCC，♀)和鯉魚（Cyprinus carpio，CC，♂）之間遠(yuǎn)緣雜交產(chǎn)生的F2代中發(fā)現(xiàn)產(chǎn)生了不減數(shù)的二倍體配子，運(yùn)用人工方法將F2代進(jìn)行自交得到了異源四倍體鯽鯉(4nAT)，目前已獲得遺傳穩(wěn)定的兩性可育的異源四倍體魚品系(

2、F3-F27)。本實(shí)驗(yàn)室通過改良紅鯽和改良異源四倍體鯽鯉進(jìn)行雜交得到了不育三倍體湘云鯽2號。三倍體魚的精巢正常發(fā)育但是卻沒有正常的精子產(chǎn)生，由于三倍體魚的性腺敗育，具有在任何水域進(jìn)行養(yǎng)殖都不會對自然界中的種質(zhì)資源造成影響的特點(diǎn)而在中國被廣泛養(yǎng)殖。Dnah3與精子的鞭毛組裝、鞭毛的運(yùn)動以及精子的活動有關(guān)。I57對維持鞭毛的長度和雙向物質(zhì)運(yùn)輸是不可或缺的，這兩個(gè)基因的異常突變都會導(dǎo)致精子鞭毛發(fā)生異常，進(jìn)而無法產(chǎn)生正常精子而敗育。本小組在前期

3、的研究中已成功構(gòu)建了不同倍性鯽鯉精巢中的miRNAs文庫，通過對miRNA的靶基因進(jìn)行預(yù)測，我們發(fā)現(xiàn)Dnah3和Ift57分別是miR-199-5p和miR-221的靶基因，在本研究中對Dnah3基因和Ift57基因的部分cDNA序列進(jìn)行了克隆，并對這兩個(gè)基因在不同倍性鯽鯉組織中進(jìn)行了半定量表達(dá)分析以及在精巢組織中進(jìn)行了定量研究分析。
　　microRNAs(miRNAs)是真核生物內(nèi)一類基因長度大約為17-24nt內(nèi)源性的非編碼

4、小分子RNA。miRNAs通過與其靶基因mRNA的3'UTR區(qū)完全或是不完全互補(bǔ)配對的方式對基因進(jìn)行表達(dá)調(diào)控。越來越多的研究表明，miRNA與器官的形成、胚胎發(fā)育、腫瘤發(fā)生以及細(xì)胞的增殖、分化、凋亡等均有密切的關(guān)系。在本文中，我們構(gòu)建了紅鯽和異源四倍體鯽鯉卵巢的miRNAs文庫，且在多個(gè)方面對文庫進(jìn)行了生物信息學(xué)分析并通過相關(guān)實(shí)驗(yàn)對所得測序數(shù)據(jù)進(jìn)行驗(yàn)證。
　　1.克隆并分析了Dnah3基因在二倍體紅鯽、異源三倍體鯽和異源四倍體鯽鯉

5、中的部分cDNA序列，并對其進(jìn)行了不同倍性鯽鯉9種組織中的差異性表達(dá)分析和研究，結(jié)果表明在精巢中的表達(dá)量高于其他組織。通過qPCR研究基因在不同倍性鯽鯉精巢中的表達(dá)。qPCR結(jié)果顯示在不育三倍體魚中的表達(dá)量比在可育二倍體魚和四倍體魚中低。
　　2.克隆并分析了Ift57基因在二倍體紅鯽、異源三倍體鯽和異源四倍體鯽鯉中的部分cDNA序列，并對其進(jìn)行了不同倍性鯽鯉9種組織中的差異性表達(dá)分析和研究，結(jié)果表明在精巢中的表達(dá)量高于其他組織。

6、通過qPCR研究基因在不同倍性鯽鯉精巢中的表達(dá)，qPCR結(jié)果顯示不育三倍體魚中的表達(dá)量比在可育的二倍體魚和四倍體魚中低。
　　3.分別取紅鯽和異源四倍體鯽鯉各三條卵巢組織樣本，提取RNA后進(jìn)行高通量測序，對數(shù)據(jù)篩選后得到的clean reads分別為:1，252，130條（HJ1♀f）、13，885，093條（HJ2♀f）、10，318，700條(HJ♀f)、12，888，037條(4n1♀f)、13，012，243條(4n2♀f

7、)、11，342，865條(4n♀f)。利用MIRDeep2軟件將miRNA序列mapped到參考基因組上，結(jié)果顯示，在二倍體紅鯽中有441條成熟的miRNAs序列;在異源四倍體鯽鯉中共有418條miRNAs序列。經(jīng)Illumina HiSeq2500測序平臺分析發(fā)現(xiàn)，相對二倍體在4nAT中有9條保守miRNAs表達(dá)下調(diào)，30條保守miRNAs和4條非保守miRNAs是表達(dá)上調(diào)。基于高通量測序的結(jié)果，我們選取了五個(gè)在不同倍性魚類卵巢中差