Dnmt1與MeCP2基因在不同倍性鯽鯉中的表達(dá)特征研究.pdf

1、Dnmt1基因是DNA甲基化轉(zhuǎn)移酶編碼基因的一種，該基因編碼DNA甲基化轉(zhuǎn)移酶1(DNMT1)，該酶對DNA甲基化的發(fā)生以及維持有著重要作用。MeCP2基因是DNA甲基CpG結(jié)合蛋白編碼基因的一種，該基因編碼甲基CpG結(jié)合蛋白2，該蛋白是神經(jīng)細(xì)胞正常發(fā)育所必須的，并能與DNMT1蛋白相互作用共同維持DNA甲基化狀態(tài)。
　　本實(shí)驗(yàn)室課題組在以往的魚類雜交育種研究中，利用紅鯽(RCC)作為母本，湘江野鯉鯉(CC)作為父本，進(jìn)行屬間遠(yuǎn)緣

2、雜交，成功培育出了世界上首例兩性可育的異源四倍體鯽鯉雜交品系，目前已經(jīng)形成遺傳穩(wěn)定的異源四倍體鯽鯉（4nAT）群體并成功繁殖了25代(F3-F25)。同時本實(shí)驗(yàn)室課題組還利用雄性異源四倍體鯽鯉與雌性二倍體紅鯽雜交，得到了不育的異源三倍體鯽魚(3n)。該三倍體、四倍體鯽鯉的形成為我們研究不同倍性魚的分子遺傳學(xué)特征以及表觀遺傳學(xué)特征提供了寶貴的實(shí)驗(yàn)材料。
　　在雜交與多倍體化過程中，表觀遺傳效應(yīng)對生物體的基因表達(dá)與表型特征起著重要的調(diào)

3、控作用。甲基化作為表觀遺傳調(diào)控的最主要方式，對4nAT，3n及其親本雌性RCC和雄性CC編碼甲基化轉(zhuǎn)移酶(DNMT1)以及甲基CpG結(jié)合蛋白2(MeCP2)的兩個基因的開放閱讀框進(jìn)行序列分析，并對兩個基因在不同倍性魚的不同組織、不同胚胎發(fā)育時期以及性腺發(fā)育不同時期的進(jìn)行表達(dá)研究，對探討異源四倍體鯽鯉，三倍體鯽鯉與其親本DNA甲基化差異有著重要意義。在實(shí)驗(yàn)室相關(guān)研究的基礎(chǔ)上，本文對Dnmt1與MeCP2基因進(jìn)行了開放閱讀框序列克隆及氨基酸

4、序列分析，同時比較分析了這兩個基因在不同倍性魚中的表達(dá)水平，為進(jìn)一步從表觀遺傳學(xué)角度探討3n的不育性特征與基因表達(dá)量的關(guān)系奠定了基礎(chǔ)。本論文的研究結(jié)果如下:
　　1.對CC、RCC、3n和4nAT Dnmt1基因與MeCP2基因的開放閱讀框序列進(jìn)行克隆，發(fā)現(xiàn)Dnmt1基因在RCC，3n和4nAT中都存在兩種類型:Dnmt1-α與Dnmt1-β;而CC中該基因只有一種類型;其中，RCC的Dnmt1-α與Dnmt1-β開放閱讀框長度分

5、別為4512bp和4521bp，分別編碼1503個氨基酸殘基和1506個氨基酸殘基。CCDnmt1基因其開放閱讀框長度為4512bp，共編碼了1503個氨基酸殘基。3n Dnmt1-α與Dnmt1-β開放閱讀框長度都為4527 bp，編碼1508個氨基酸殘基。4nAT Dnmt1-α與Dnmt1-β開放閱讀框長度分別為4512bp與4506 bp，各編碼1503、1501個氨基酸殘基。而MeCP2基因在CC、3n和4nAT中存在兩種類型

6、，MeCP2-α與MeCP2-β，而RCC中該基因只有一種類型;RCC該基因開放閱讀框全長為1635 bp，編碼544個氨基酸;CC的MeCP2-α與MeCP2-β開放閱讀框全長度分別為1638 bp和1623 bp，分別編碼545和540個氨基酸殘基。3n兩種類型MeCP2-α與MeCP2-β開放閱讀框序列長度分別為1623 bp和1632bp，分別編碼540和543個氨基酸殘基。4nAT的兩種類型MeCP2-α與MeCP2-β開放閱

7、讀框序列長度分別為1623 bp和1638 bp，分別編碼540和545個氨基酸殘基。通過對比分析4nAT、3n及其父母本Dnmt1基因和MeCP2基因開放閱讀框序列，發(fā)現(xiàn)兩種多倍體雜合子兩個基因編碼區(qū)都發(fā)生了插入、重組等變異。
　　2.采用RT-PCR的方法比較分析Dnmt1基因在四種魚不同組織中的mRNA表達(dá)情況，發(fā)現(xiàn)在四種魚的肌肉，腦，心臟，肝臟，脾臟，腎臟，卵巢和精巢組織中，都有Dnmt1基因的表達(dá)信號，但是在腦組織和性腺

8、組織中，其mRNA表達(dá)量相對較高，而在肌肉組織中mRNA表達(dá)量最低。同樣地，采用RT-PCR與Q-PCR的方法比較分析Dnmt1基因在四種魚胚胎發(fā)育各個時期的表達(dá)情況，發(fā)現(xiàn)在胚胎發(fā)育多細(xì)胞期至囊胚早期Dnmt1基因mRNA表達(dá)水平較高，隨著胚胎的繼續(xù)發(fā)育，Dnmt1基因表達(dá)水平呈顯著降低，原腸胚期后維持低水平狀態(tài)。同時，通過比較研究四種魚Dnmt1基因在繁殖期與非繁殖期性腺中的表達(dá)情況，發(fā)現(xiàn)在兩個不同時期，Dnmt1基因在卵巢中的表達(dá)均

9、比精巢中表達(dá)高，并且，在不育3n中，Dnmt1基因的表達(dá)量低于可育RCC和4nAT，而四種魚精巢中Dnmt1基因的表達(dá)沒有顯著差異，該結(jié)果表明Dnmt1基因與卵巢的發(fā)育密切相關(guān)。
　　3.采用RT-PCR的方法比較分析MeCP2基因在四種魚不同組織中的mRNA表達(dá)情況與Dnmt1基因表達(dá)結(jié)果相似，MeCP2基因在四種魚的肌肉，腦，心臟，肝臟，脾臟，腎臟，卵巢和精巢中均有表達(dá)，且在腦組織中的表達(dá)量最高，而性腺中表達(dá)量較高。采用RT-

10、PCR的方法以及Q-PCR，比較分析MeCP2基因在四種魚胚胎發(fā)育各個時期的表達(dá)情況，發(fā)現(xiàn)在胚胎發(fā)育時期多細(xì)胞期至囊胚早期MeCP2基因mRNA表達(dá)水平較高，到原腸胚后表達(dá)量下降，然后維持低表達(dá)水平直到出膜期。這也與Dnmt1基因在胚胎發(fā)育不同時期的結(jié)果相似。進(jìn)一步的，通過比較研究四種魚性腺在繁殖期與非繁殖期MeCP2基因的表達(dá)情況，發(fā)現(xiàn)在四種魚中，MeCP2基因在繁殖期的表達(dá)都要低于非繁殖期;并且MeCP2基因在3n卵巢中的表達(dá)量水平