鵝肥肝生成相關miRNAs、基因的鑒定及功能研究和就巢性相關miRNAs的鑒定.pdf

1、較強的就巢性和肝臟脂肪酸合成與儲存能力是鵝的兩大特點。miRNAs可以對基因表達進行轉錄后調控。浙東白鵝為江浙一帶主要的鵝地方品種，具有強烈的就巢性。朗德鵝肝臟具有很強的脂肪酸合成能力與儲存能力，是生成鵝肥肝的主要鵝品種。本試驗通過高通量測序技術分別研究了與浙東白鵝就巢性狀相關和與朗德鵝肥肝形成相關的miRNAs。除此以外，對朗德鵝肝臟脂肪代謝機理進行了更深一步的研究。包括采用RNA-Seq技術對正常飼養(yǎng)的朗德鵝和填飼朗德鵝的肝臟進行轉

2、錄組測序;選擇測序結果中差異表達的基因中與肝臟脂肪酸合成相關的基因，對其序列進行擴增;并對這些基因的組織特異性進行了分析;最后在細胞水平研究了硬脂酸、亞油酸、葡萄糖和胰島素對這些基因表達的影響。主要研究結果如下:
　　1、與浙東白鵝就巢性狀相關miRNAs的研究
　　鵝就巢行為主要受下丘腦-垂體-性腺軸調控。運用高通量測序技術和生物信息學分析，我們對處于就巢期和產蛋期浙東白鵝下丘腦中miRNAs的表達譜進行了分析。在就巢組和

3、產蛋組鵝下丘腦中，我們分別獲得了11053784條序列和8801405條序列。在這些小RNA序列中，miRNAs在其中所占的比例最高，分別在就巢組和產蛋組中占小RNA總數(shù)的75.61％和79.82％。對這些小RNA的長度分布進行分析得出22 nt的小RNA所占比例最高。下丘腦中表達量最高的miRNA家族為Let-7。對就巢組和產蛋組中差異表達的miRNAs進行分析，我們鑒定出38種在就巢組中表達上調的miRNAs和14種表達下調的miR

4、NAs（至少在一個組中閱讀數(shù)大于1000，且變化倍數(shù)大于2，P＜0.001）。在這些差異表達的miRNAs中，miR-30d，miR-30e，miR-148a-3p，miR-30a和miR-146c在兩個試驗組中都具有很高的表達量。除了已知miRNAs外，我們還在下丘腦中發(fā)現(xiàn)158種新miRNAs，包括在就巢組發(fā)現(xiàn)的114種新miRNAs和產蛋組中發(fā)現(xiàn)的94種新miRNAs。我們列出了其中12種閱讀數(shù)至少在一組中大于100的新miRNA

5、s。在這12種新miRNAs中，有1種在就巢組中表達顯著下調，有3種在就巢組中表達顯著上調。
　　2、與朗德鵝肥肝形成相關的miRNAs的研究
　　朗德鵝肝臟具有很強的脂肪酸沉積能力。經過21 d填飼后，與正常飼喂朗德鵝相比，其在體重增加了1.5倍的同時，肝重增長了4倍。組織學觀察可在肝臟中觀察到大量的脂滴。通過高通量測序和生物信息學分析，我們分別在正常肝和肥肝中檢測出10396977條和11321273條序列，這其中分別有

6、88.92％和86.98％的序列為miRNAs。對小RNAs的長度分布分析得出22 nt的小RNAs所占比例最高。miR-122在肝臟中的表達量非常高，在對照組和填飼組中分別占miRNA總量的70.34％和72.01％，但miR-122在兩個試驗組間表達無顯著性差異。與對照組肝臟相比，我們在肥肝中鑒定出22個表達上調的miRNAs和12個表達下調的miRNAs(歸一化表達量至少在一組中大于100.0，改變倍數(shù)大于2且P＜0.001)。m

7、iR-222和miR-30d分別為上調和下調的miRNAs中表達量最高的。在鵝肝臟中，我們共鑒定出67種新miRNAs，其中有3種在兩組間差異表達（至少在一組中歸一化表達量大于10.0，且變化倍數(shù)大于2，P＜0.001）。在miR-125b對預測靶基因ACSL1的miRNA/mRNA相互作用的驗證試驗中，轉入miR-125bmimic與轉入陰性對照相比，構建的ACSL1基因3'-UTR的熒光素酶活性降低為陰性對照組的57.3％。

8、　　3、運用RNA-Seq技術分析朗德鵝填飼后轉錄水平的變化情況
　　運用RNA-Seq技術分析正常飼喂與填飼朗德鵝肝臟的轉錄組，我們分別在對照組和填飼組肝臟中獲得了50198914條和49172954條reads。與參考基因組比對上的reads分別在兩組占了52.85％和48.74％。與參考基因比對上的reads分別在兩組中占總reads的36.61％和32.88％。兩個試驗組中存在最多的可變剪接類型為3'端可變剪接，其次為5'

9、端可變剪接。以FADS2基因為例，我們共檢測到5種可變剪接。對兩個試驗組中基因的轉錄水平進行比較，我們在填飼組鵝肥肝中共檢測到602個表達上調的基因和200個表達下調的基因。在這些差異表達的基因中，我們篩選出與糖類代謝和脂類代謝相關的33個表達上調的基因和13個表達下調的基因。在這些基因中，表達下調的基因ACSL1，HMGCS1與表達上調的基因PDGDS，CYP2C45，ADS1，ADS1，Elovl6，17β-HSD，F(xiàn)AS，ACS，

10、SCD1在肝臟都有很高的表達水平。
　　4、脂肪酸合成相關基因的克隆與組織表達
　　本試驗克隆的ACSL1基因cDNA序列共3709 bp，其中包括119 bp的5'非編碼區(qū)(5'-UTR)，2097 bp的編碼區(qū)（CDS區(qū)）和1493 bp的3'非編碼區(qū)(3'-UTR)。CDS序列編碼699個氨基酸，與鴨和雞同源性分別為98.14％和93.71％。在填飼后，肝臟和腎臟中ACSL1基因表達顯著下調，腹脂和心臟中ACSL1基因

11、表達顯著上調。與對照組相比，肝臟中SCD1基因表達量在填飼后增長了22.23倍，在胸肌、腿肌和腹脂中表達量也顯著上升。本試驗克隆的Elovl6基因cDNA片段序列共2782 bp。其中包括74 bp的5'-UTR，798 bp的CDS區(qū)和1909 bp的3'-UTR。CDS共編碼了266個氨基酸，與雞氨基酸序列的同源性為98.49％。填飼后，肝和脾中Elovl6的表達量顯著升高，分別增長了2.04倍和6.02倍。擴增的FADS1基因cD

12、NA全序列全長3147bp，其中包括314 bp的5'-UTR區(qū)，1083 bp的CDS區(qū)和1750 bp的3'-UTR區(qū)。CDS區(qū)編碼361個氨基酸，氨基酸序列與鴨的同源性為98.61％，而與雞只有79.14％。填飼后，該基因在肝臟和脾中的表達量分別增長了2.61倍和2.89倍?？寺〉涅ZFADS2基因CDS序列全長1335bp，共編碼445個氨基酸，與鴨和雞的同源性分別為97.07％和93.69％。填飼后，肝臟中FADS2基因的表達量

13、增加了3.09倍。
　　5、硬脂酸、亞油酸、葡萄糖和胰島素對鵝原代肝細胞脂質沉積和脂肪酸合成相關基因表達的影響
　　通過不同濃度的硬脂酸(SA)、亞油酸(LA)、葡萄糖和胰島素處理鵝原代肝細胞24 h，檢測細胞脂質積累情況和脂肪酸合成相關基因的表達變化情況。結果表明，與對照組相比，低濃度的SA和LA(50μM和100μM)可以誘導細胞月旨肪沉積，而高濃度(150μM)對細胞脂肪沉積無顯著影響。低濃度的葡萄糖和胰島素對細胞脂肪

14、沉積影響較小，而高濃度葡萄糖（100mM）和胰島素(200 nM)對其具有較強的刺激作用。不同濃度SA都可以刺激FAS, FADS1和Elovl5基因表達，100μM的SA可以刺激ACSL1表達，150μM的SA使SCD1基因表達上調。不同濃度的LA可以刺激FAS, FADS1，Elovl5和ACSL1的表達，50μM的LA可以上調FADS2表達。不同濃度的葡萄糖可以誘導FAS，Elovl5表達，50 mM和100mM的葡萄糖可以刺激S