一種新的腫瘤相關(guān)抗原MGb2-Ag-TRAK1的鑒定和功能研究.pdf

1、【背景】
　　MGb2是本研究所建立的一種胃腸道腫瘤特異性單克隆抗體。利用該抗體檢測胃癌敏感性高、特異性強(qiáng)，對胃印戒細(xì)胞癌尤為明顯。但是，該抗體建立20年來，其識別抗原MGb2-Ag一直沒有鑒定成功，故對其的認(rèn)識非常有限。
　　【目的】
　　進(jìn)一步觀察MGb2-Ag在人體多種組織中的表達(dá)分布特征，明確其在胃癌發(fā)生發(fā)展中的臨床病理診斷價值，鑒定MGb2-Ag，并研究其在腫瘤細(xì)胞中可能的作用。
　　【方法】
　

2、　（1）用免疫組化方法檢測人體多種組織中MGb2-Ag的表達(dá)分布特征。
　?。?）以141例胃癌（n=81）和非胃癌患者（n=60）的胃組織石蠟切片標(biāo)本作為研究對象，用免疫組化方法評價MGb2-Ag在胃癌發(fā)生發(fā)展中的臨床病理診斷價值。免疫組化染色結(jié)果判斷結(jié)合染色細(xì)胞數(shù)量和染色程度進(jìn)行綜合評分分析。
　　（3）用Westernblotting檢測7種胃癌細(xì)胞系和1種胃黏膜上皮細(xì)胞永生化細(xì)胞系GES-1中MGb2-Ag的表達(dá)，并

3、初步確定目的蛋白的分子量。
　?。?）以胃癌細(xì)胞系和新鮮胃癌組織為材料，用免疫沉淀技術(shù)（IP）富集MGb2-Ag，SDS-PAGE膠分離目的抗原后切膠進(jìn)行MALDI-TOF質(zhì)譜分析和生物信息學(xué)分析，獲得候選分子為TRAK1（Traffickingprotein,kinesin-binding1)。
　?。?）以下列方法進(jìn)一步鑒定MALDI-TOF質(zhì)譜分析結(jié)果：用抗TRAK1抗體和MGb2抗體檢測原核表達(dá)的TRAK1蛋白，用兩

4、種抗體分別檢測組織連續(xù)切片中TRAK1和MGb2-Ag蛋白的組織表達(dá)特征和亞細(xì)胞定位特征。
　　（6）借助RNAi（RNAinterference）技術(shù)，設(shè)計Trak1siRNAs，構(gòu)建其表達(dá)質(zhì)粒，轉(zhuǎn)染胃癌細(xì)胞系MKN-45，篩選有效靶序列，觀察轉(zhuǎn)染Trak1siRNAs對腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞周期和細(xì)胞凋亡的影響。
　　【結(jié)果】
　　（1）MGb2-Ag在人體多種組織中的表達(dá)特征：組織和器官不同，MGb2-Ag表達(dá)水平不同；

5、在人癌組織，特別是胃癌中高表達(dá)；在處于癌前狀態(tài)的組織中（胃、結(jié)腸和膽囊等）弱表達(dá)；正常組織中幾乎不表達(dá)；在正常胰腺的胰島和腦灰質(zhì)神經(jīng)元中，能夠觀察到特異性的表達(dá)。
　　（2）胃癌組織分化越差(P=0.015),腫瘤細(xì)胞侵襲深度越深(P<0.001)，腫瘤細(xì)胞淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的發(fā)生越多(P=0.011)，MGb2-Ag表達(dá)水平越高。隨機(jī)挑選胃癌患者癌旁組織標(biāo)本（n=16）檢測MGb2-Ag，發(fā)現(xiàn)其在癌組織中的表達(dá)高于相應(yīng)癌旁組織(P=0.

6、001)。同時，本研究觀察到慢性淺表性胃炎組織中MGb2-Ag的表達(dá)低于其在癌前狀態(tài)組織（本研究包括萎縮性胃炎、腸上皮化生、胃息肉）中的表達(dá)（P=0.005）。MGb2-Ag在胃癌中陽性率為81.48％（66/81），其中，在胃印戒細(xì)胞癌和粘液細(xì)胞癌的中陽性率為100％(23/23)；MGb2-Ag在癌前狀態(tài)組織中陽性率為13.16％(5/38)，在慢性淺表性胃炎組織中陽性率為0％（0/22）；胃癌組織中MGb2-Ag的陽性率高于所有非

7、癌組織（P<0.001）。
　?。?）MGb2-Ag在7種胃癌細(xì)胞系中呈不同程度的表達(dá)，但在人永生化胃黏膜細(xì)胞系GES-1中的表達(dá)很弱。該抗原用Westernblotting可檢測到2條蛋白質(zhì)條帶，分子量分別為～115kDa和～100kDa，所有細(xì)胞樣品皆有的條帶是～100kDa。明顯呈兩條條帶的細(xì)胞是MKN-45、SGC-7901和AGS細(xì)胞。
　?。?）切取從MKN-45細(xì)胞、KATOIII細(xì)胞和胃癌組織中富集到的目的抗

8、原MGb2-Ag條帶（～100kDa），MALDI-TOF質(zhì)譜分析結(jié)果均顯示候選分子均為TRAK1。原核表達(dá)的TRAK1蛋白能夠被MGb2單抗和羊TRAK1多抗所識別。用MGb2單抗和羊TRAK1多抗檢測胃癌、腸上皮化生、慢性淺表性胃炎等組織的連續(xù)切片，發(fā)現(xiàn)染色定位、細(xì)胞類型等特征高度一致。
　　（5）成功構(gòu)建Trak1siRNA表達(dá)載體，篩選出2對針對Trak1的siRNA，瞬時轉(zhuǎn)染MKN-45細(xì)胞，與對照siRNA比較，兩者均

9、顯著減少細(xì)胞凋亡，促進(jìn)細(xì)胞周期從G1期向S期進(jìn)展。
　　【結(jié)論】
　　本研究進(jìn)一步觀察了MGb2-Ag在人體多種組織的分布特征；發(fā)現(xiàn)MGb2-Ag是胃癌發(fā)生發(fā)展過程中一種有意義的病理診斷標(biāo)志物，MGb2-Ag表達(dá)增加可能是胃癌發(fā)生的早期事件；成功鑒定MGb2-Ag為一種新分子TRAK1，首次發(fā)現(xiàn)TRAK1是一種新的胃癌診斷標(biāo)志物；本研究還借助RNAi介導(dǎo)的TRAK1低表達(dá)效應(yīng)，首次研究了TRAK1在腫瘤細(xì)胞中的功能，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染