microRNA-148a抑制胃癌侵襲轉(zhuǎn)移的機(jī)制研究.pdf

1、microRNA是一種內(nèi)源性小分子非編碼RNA，通過(guò)與靶基因3’-UTR結(jié)合，抑制其靶基因表達(dá)來(lái)發(fā)揮調(diào)控作用。在細(xì)胞增殖、分化、凋亡等各個(gè)方面都有microRNA的參與。microRNA與腫瘤密切相關(guān)，可以作為癌基因或抑癌基因在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要的作用。胃癌是我國(guó)最常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，其發(fā)病機(jī)制仍然不甚清楚，治療效果也并不理想。研究microRNA與胃癌的關(guān)系有助于明確胃癌的發(fā)病及其轉(zhuǎn)移的機(jī)制，從而找到治療胃癌的新方法。本研究將初

2、步探討microRNA-148a在胃癌侵襲轉(zhuǎn)移中的作用及其機(jī)制。
　　方法：
　　1.用 Realtime PCR方法檢測(cè)60對(duì)胃癌組織及癌旁正常組織的microRNA-148a的表達(dá)量。
　　2.構(gòu)建 microRNA-148a慢病毒表達(dá)質(zhì)粒，包裝慢病毒，轉(zhuǎn)染胃癌細(xì)胞MKN-45，建立穩(wěn)定的microRNA-148a過(guò)表達(dá)MKN-45細(xì)胞株，并建立對(duì)照細(xì)胞株。
　　3.細(xì)胞遷移與侵襲實(shí)驗(yàn)分析過(guò)表達(dá)microRN

3、A-148a的MKN-45細(xì)胞株與對(duì)照細(xì)胞株的體外侵襲能力，并檢測(cè)上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化相關(guān)蛋白（E-Cadherin、Vimentin）的表達(dá)情況。
　　4.使用Targetsan等預(yù)測(cè)microRNA-148a靶基因，使用Realtime PCR、免疫印跡、熒光素酶報(bào)告基因等方法證實(shí)。
　　結(jié)果：
　　1. Realtime PCR顯示與正常胃粘膜組織相比，胃癌組織中的microRNA-148a的表達(dá)量顯著降低（P<0.01

4、），其中54例（90％）胃癌組織較正常組織microRNA-148a表達(dá)下調(diào)，37例（61%）下調(diào)2倍以上。通過(guò)臨床病理分析顯示microRNA-148a在淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、TNM分期較晚、有血管浸潤(rùn)的胃癌中表達(dá)更低。
　　2.體外遷移與侵襲實(shí)驗(yàn)顯示： microRNA-148a可以在體外抑制胃癌細(xì)胞的遷移與侵襲（P<0.05）。
　　3.免疫印跡法顯示：過(guò)表達(dá) microRNA-148a后使 E-Cadherin表達(dá)上調(diào)，Vim

5、entin表達(dá)下調(diào)，提示microRNA-148a抑制上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化。
　　4. Realtime PCR及免疫印跡法顯示：過(guò)表達(dá)microRNA-148a的MKN-45細(xì)胞株 Smad2基因及蛋白水平表達(dá)下調(diào)。熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)顯示熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)顯示Smad2野生型3’-UTR與microRNA-148a結(jié)合后抑制熒光素酶活性（P<0.01）。說(shuō)明microRNA-148a靶向作用于Smad2的3’-UTR區(qū)，下調(diào)Smad