microRNA-33a通過(guò)靶向HIF-1α抑制黑色素瘤侵襲轉(zhuǎn)移的分子機(jī)制研究.pdf

1、研究目的:探討miR-33a/b在不同轉(zhuǎn)移潛能人皮膚黑色素瘤細(xì)胞系中的表達(dá)特點(diǎn)和意義。干預(yù)不同人皮膚黑色素瘤細(xì)胞系中miR-33a/b表達(dá)后，體外實(shí)驗(yàn)水平觀察細(xì)胞的增殖、粘附、運(yùn)動(dòng)、凋亡和上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化等腫瘤細(xì)胞惡性生物學(xué)功能的變化。干預(yù)黑色素瘤A375細(xì)胞中miR-33a表達(dá)后，在體實(shí)驗(yàn)水平觀察裸鼠皮下種植瘤的大小、體積、質(zhì)量及肺臟轉(zhuǎn)移灶數(shù)目的變化情況。探討miR-33a/b影響人黑色素瘤細(xì)胞惡性生物學(xué)功能的可能機(jī)制。
　　研究

2、方法:通過(guò)real-time PCR法檢測(cè)miR-33a/b在低轉(zhuǎn)移侵襲力的皮膚黑色素瘤細(xì)胞株WM35及高轉(zhuǎn)移侵襲力的皮膚黑色素瘤細(xì)胞株WM451、A375和SK-MEL-1中的表達(dá)量。明確miR-33a/b在黑色素瘤細(xì)胞系中的表達(dá)情況，篩選miR-33a/b高表達(dá)和低表達(dá)的黑色素瘤細(xì)胞系作為進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)研究對(duì)象。構(gòu)建pYr-LVX-pri-miR-33a慢毒載體，并將其包裝成慢病毒，然后感染A375細(xì)胞，建立hsa-miR-33a穩(wěn)定

3、過(guò)表達(dá)細(xì)胞系A(chǔ)375-pYr-LVX-pir-miR-33a;構(gòu)建pYr-LVX-miR-33 a-sponge慢病毒載體，并將其包裝成慢病毒，然后分別感染W(wǎng)M35、WM451細(xì)胞，建立hsa-miR-33a表達(dá)抑制的穩(wěn)定細(xì)胞系WM35-pYr-LVX-miR-33 a-sponge和WM451-pYr-LVX-miR-33a-sponge。以miR-33a表達(dá)穩(wěn)定上調(diào)/抑制細(xì)胞系為研究對(duì)象，運(yùn)用MTT法檢測(cè)細(xì)胞增殖能力;平板克隆形成實(shí)

4、驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞克隆數(shù);流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡率;細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)、Transwell實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞遷移侵襲力;Western Blot法檢測(cè)與EMT相關(guān)的E-鈣粘連蛋白（E-Cadherin）、N-鈣粘連蛋白(N-Cadherin)的表達(dá)情況。多層面探討miR-33a的表達(dá)對(duì)細(xì)胞增殖、細(xì)胞凋亡、侵襲轉(zhuǎn)移和EMT等表型的影響。通過(guò)皮下接種及尾靜脈注射A375及A375-pYr-LVX-pir-miR-33a細(xì)胞建立裸鼠種植瘤及移植瘤模型，觀察裸鼠皮

5、下種植瘤的大小、體積、質(zhì)量及肺臟轉(zhuǎn)移灶數(shù)目的變化情況。采用生物信息學(xué)分析法預(yù)測(cè)HIF-1α可能為miR-33a的下游靶因;Western Blot法檢測(cè)miR-33a表達(dá)變化時(shí)HIF-1α蛋白的表達(dá)水平;應(yīng)用雙熒光素酶基因報(bào)告法進(jìn)一步驗(yàn)證HIF-1α是否為miR-33a的直接靶基因。
　　研究結(jié)果:miR-33a與miR-33b在低轉(zhuǎn)移侵襲力的人皮膚黑色素瘤細(xì)胞株WM35中表達(dá)量均高，而在高轉(zhuǎn)移侵襲力的人皮膚黑色素瘤細(xì)胞株WM45

6、1、A375和SK-MEL-1中的表達(dá)量相對(duì)較低(WM35＞W(wǎng)M451＞A375＞SK-MEL-1);上調(diào)A375細(xì)胞株中miR-33a的表達(dá)能抑制細(xì)胞增殖、侵襲轉(zhuǎn)移和上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化;抑制WM451和WM35細(xì)胞株中miR-33a的表達(dá)能促進(jìn)細(xì)胞增殖、侵襲轉(zhuǎn)移和上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化;miR-33a對(duì)細(xì)胞凋亡的影響無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。miR-33a能抑制種植瘤的形成速度，減少肺臟轉(zhuǎn)移灶的數(shù)目。生物信息學(xué)預(yù)測(cè)HIF-1α為miR-33a的下游靶基因。過(guò)

7、表達(dá)A375中miR-33a的表達(dá)后，HIF-1α的表達(dá)下降;抑制WM35、WM451中miR-33a的表達(dá)后HIF-1α的表達(dá)上升。雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步證實(shí)HIF-1α為miR-33a的直接靶基因。
　　研究結(jié)論:miR-33a與miR-33b在低轉(zhuǎn)移侵襲力的人皮膚黑色素瘤中的表達(dá)量高于高轉(zhuǎn)移侵襲力的人皮膚黑色素瘤。miR-33a能抑制人黑色素瘤細(xì)胞株的細(xì)胞增殖、侵襲轉(zhuǎn)移，調(diào)節(jié)上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化過(guò)程，但不影響細(xì)胞凋亡;miR-3