MicroRNA let-7a在體外血管生成中的作用及其機制研究.pdf

1、目的：
　　血管生成對人類健康有很大的影響，它不僅參與生長發(fā)育和傷口愈合，而且與許多疾病的發(fā)病機理相關(guān)。微小RNA（microRNA，miRNA）是內(nèi)源性非編碼小RNA，大約長20~23個核苷酸，參與調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖、凋亡等過程，其失調(diào)與人類眾多疾病相關(guān)，其中包括腫瘤。Let-7a是目前研究最廣泛、最熱門的miRNA之一，大量研究證實它是一個腫瘤抑制基因，但其在血管生成中的作用尚不清楚。本文旨在研究let-7a在人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞（HU

2、VECs）體外血管生成中的作用，并對其分子機制進行初步探索。
　　方法：
　　⑴經(jīng)生物信息學(xué)分析表明TGFBR3是一個let-7a直接靶向調(diào)控的潛在靶基因，并且通過構(gòu)建TGFBR3基因3’UTR的野生型和突變型重組雙熒光素酶報告載體，再分別與let-7a模擬物（let-7a mimics）或let-7a陰性對照（let-7a NC）共同轉(zhuǎn)染HEK293T細(xì)胞，收集樣本后經(jīng)雙熒光素酶報告系統(tǒng)對各組細(xì)胞的熒光素酶活性進行檢測。⑵

3、通過脂質(zhì)體將 let-7a mimics和 let-7a NC分別轉(zhuǎn)染進入 HEK293T細(xì)胞和HUVECs，并且用RT-qPCR分析TGFBR3基因的mRNA水平的表達量以及Western Blot分析TGFBR3基因的蛋白水平的表達量。⑶通過脂質(zhì)體將 let-7a mimics/siRNA-TGFBR3及其陰性對照分別轉(zhuǎn)染入HUVECs，再利用小管形成實驗來研究let-7a過表達或敲低TGFBR3對體外血管生成的作用；用劃痕實驗來確

4、定let-7a過表達或敲低TGFBR3后HUVECs的細(xì)胞遷移能力。⑷通過脂質(zhì)體將let-7a mimics/siRNA-TGFBR3及其對照分別轉(zhuǎn)染入HUVECs，再利用RT-qPCR檢測受let-7a/TGFBR3通路調(diào)控的下游基因VEGFC、MMP9、ID1和PROX1的mRNA表達量。
　　結(jié)果：
　?、俳?jīng)過公司測序鑒定，我們成功構(gòu)建TGFBR33’UTR野生型和突變型重組雙熒光素酶報告載體。經(jīng)檢測發(fā)現(xiàn)，共轉(zhuǎn)染TGF

5、BR33’UTR野生型報告載體和let-7a mimics組的熒光素酶活性比值比let-7a NC組明顯降低（P＜0.05），而共轉(zhuǎn)染let-7a mimics和TGFBR33’UTR突變型重組雙熒光素酶報告載體組的熒光素酶活性比值無顯著改變（P＞0.05）。②在HEK293T細(xì)胞中，轉(zhuǎn)染let-7a mimics組中TGFBR3的mRNA表達量顯著低于let-7a NC組，約下降了一半；Western Blot結(jié)果顯示let-7a m

6、imics組的TGFBR3蛋白表達量同樣顯著低于let-7a NC組，大約下降了一半（P＜0.05）。另外在HUVECs中，let-7a mimics組TGFBR3的mRNA和蛋白水平也都低于let-7a NC組，大約下降一半左右（P＜0.05）。③在小管形成實驗中，過表達let-7a或敲降TGFBR3后，HUVECs形成的管狀數(shù)量均比對照組明顯減少（P＜0.05）。另外在細(xì)胞劃痕實驗中，過表達let-7a或敲降TGFBR3后的實驗組中

7、觀察到細(xì)胞遷移的距離和面積都比對照組顯著下降（P＜0.05）。④在過表達let-7a或敲降TGFBR3后，受let-7a/TGFBR3通路調(diào)控的下游基因VEGFC和MMP9的mRNA表達量均出現(xiàn)下降，而ID1和PROX1僅在過表達let-7a組中出現(xiàn)下降（P＜0.05），在敲降TGFBR3組中卻無明顯變化（P＞0.05）。
　　結(jié)論：
　　⑴成功構(gòu)建pmirGLO-TGFBR33’UTR-WT和pmirGLO-TGFBR33

8、’UTR-MUT兩種重組雙熒光素酶報告載體。⑵let-7a能夠直接結(jié)合到TGFBR3基因3’UTR的let-7a結(jié)合位點負(fù)調(diào)控TGFBR3基因的表達，表明TGFBR3是一個新發(fā)現(xiàn)的let-7a直接調(diào)控的靶基因。⑶小管形成實驗和劃痕實驗表明let-7a可以抑制HUVECs的體外血管生成和細(xì)胞遷移能力。⑷小管形成實驗和劃痕實驗表明敲降TGFBR3的表達抑制HUVECs的體外血管生成和細(xì)胞遷移能力。⑸let-7a通過靶向調(diào)控HUVECs中TG